0 次观看 • 3:30 分钟 • July 31st, 2026
从感染细胞在特定时间间隔收集含有轮状病毒颗粒的培养上清液开始。
加入胰蛋白酶以切割病毒外层衣壳蛋白，暴露宿主附着位点。
将宿主细胞与稀释的病毒悬液孵育，并间歇性振荡。
病毒附着于宿主并被内化。
移除接种物，并加入含有支持再感染的胰蛋白酶的琼脂糖培养基。
琼脂糖凝固后限制了病毒的扩散，确保局部感染。
内化的病毒进行复制，导致细胞裂解，并释放出感染邻近细胞的病毒粒子。
病毒复制导致细胞裂解，形成透明区域或噬斑。
加入一种可对活细胞进行染色的染料，使噬斑保持未染色状态。
去除多余的染料并进行孵育以增强对比度。
计数蚀斑，并应用数学模型绘制轮状病毒的生长曲线。
曲线显示了适应期的滞后期、指数生长期以及由于资源限制导致复制减缓的稳定期。
将上清液于-80摄氏度保存，直至用于空斑试验以测定病毒滴度。
当准备进行蚀斑试验时，将装有收集上清液的试管置于37摄氏度水浴中。向1毫升10倍稀释的样品中加入胰蛋白酶，并在37摄氏度孵育30分钟。在此30分钟孵育期间，移除含血清培养基后，用2毫升1×PBS小心洗涤六孔板中的MA104细胞。
将孵育后的样品用无血清培养基进行系列稀释，每孔接种1毫升稀释后的样品。将培养板置于37摄氏度、5% CO2及饱和蒸汽条件下孵育90分钟，每隔15分钟轻轻振荡培养板一次。孵育结束后，从六孔板中移除接种液。
向制备好的培养基中加入终浓度为4微克/毫升的胰蛋白酶。立即将3毫升含琼脂糖凝胶的培养基轻柔地加入每个孔中。室温下静置10分钟以上，使琼脂糖凝胶充分凝固。
然后将培养板置于37摄氏度、5% CO2及饱和水蒸气条件下孵育2天。接着向每孔加入1毫升用1X PBS稀释的0.015%中性红溶液，在相同条件下继续孵育。3小时后移除染料，并继续孵育1天。
第二天，计数每个孔中的噬斑数量，并计算每毫升的噬斑形成单位（pfu）。进行噬斑测定前，仔细检查细胞汇合度，以确保噬斑数量的准确性。