利用体外全可培养病毒检测法定量水样中的感染性病毒

取自水样中浓缩的病毒悬液。以等量接种物体积接种哺乳动物肾细胞，接种物中可能含有不同数量的感染性病毒。
倾斜培养容器以铺展悬液。
在振荡条件下孵育，使病毒与细胞表面受体结合。
加入培养基并继续孵育。
病毒进入宿主细胞并释放其基因组。这些基因组进行复制并合成病毒蛋白，组装成新的病毒颗粒。
感染的细胞会发生结构改变或死亡，这一现象被称为细胞病变效应（CPE）。
某些培养物因病毒接种剂量较低而仍呈CPE阴性。
冷冻并解冻培养物以裂解细胞。
过滤出现细胞病变效应（CPE）的培养物以获得澄清的病毒悬液；同时，从无细胞病变效应（CPE）的培养物中收集未经过滤的悬液。
将悬液接种至新鲜宿主细胞并进行培养。
连续传代两次出现细胞病变效应（CPE），可证实存在具有感染性的病毒。
利用确认为CPE阳性的培养物数量来估算水样中感染性病毒的浓度。
接种10个含有BGM细胞单层的测试容器，每个测试样品接种量等于子样品一的接种体积，同时设置完全可培养病毒量子检测对照。对于实验室加标空白和实验室加标样品基质，使用子样品三和0.15摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.0至7.5）作为稀释液，制备5倍、25倍和125倍稀释液。除接种未稀释子样品一的容器外，还需为每个稀释系列分别接种10个经洗涤的细胞培养测试容器，每个测试容器接种指定体积的接种物。
将接种物通过前后倾斜容器的方式均匀分布于细胞单层表面。将试验容器置于室温下，在机械摇床平台上以每分钟1至5次振荡的频率孵育80–120分钟，或每15–20分钟手动摇动容器一次，以使可能存在的病毒充分吸附于细胞。随后，向试验容器中加入预热的维持培养基，再将容器置于36.5 ± 1 °C条件下孵育。
在最初3天内，使用显微镜观察每个试验容器中细胞病变效应的出现情况，随后每隔2至3天检查一次，直至第14天。将显示超过75%细胞病变效应的任何试验容器转移至设定为或低于零下70摄氏度的冰箱中冷冻。在最后一天检查完所有容器后，将所有剩余的培养物以及总可培养病毒量子检测试验对照组在或低于零下70摄氏度条件下冷冻。
然后，解冻所有培养物，并通过0.2微米除菌滤器过滤每个出现细胞病变效应（CPE）阳性反应的测试容器中超过15%的培养基。下一步是对所有第一代传代的测试容器进行第二代传代，使用经洗涤的BGM肾细胞测试容器。具体操作为：用相当于所有阴性测试容器解冻后培养基以及阳性容器过滤后培养基体积10%的接种量，接种至新的测试容器中。
重复首次传代所进行的步骤，将首次传代为阴性而第二次传代为阳性的所有检测容器进行冻存。随后，仅使用首次传代为阴性且第二次传代为阳性的阴性检测对照和细胞培养物，按照第二次传代所述方法进行第三次传代。当某个检测容器在第一次和第二次传代中均出现细胞病变效应，或在细胞病变效应直至第二次传代才出现的情况下于第二次和第三次传代中均出现该效应时，可将其判定为病毒阳性。
使用美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency）的最可能数（Most Probable Number）计算器，按照文本方案中设定的默认程序参数，计算所有测试样本的病毒滴度。然后，根据所获得的每毫升感染单位的最可能数及其每毫升的上下置信限，按照文本方案中的描述，计算每升感染单位的最可能数及相应的置信限。