血液来源巨噬细胞携带纳米制剂抗逆转录病毒药物的方法学开发

本实验的目的是制备并检测结晶型抗逆转录病毒纳米颗粒（即我们所称的“纳米ART”）的细胞摄取、分泌及抗逆转录病毒特性。首先通过超声均质化或湿法研磨处理抗逆转录病毒药物以完成制备。在分离出原代单核细胞后，实验的第二步是对纳米ART颗粒的物理特性进行表征。

在含有巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）的DMEM培养基中培养7天，以诱导其分化为单核细胞来源的巨噬细胞。第三步是检测纳米抗逆转录病毒药物（nano ART）在人单核细胞来源巨噬细胞中的摄取、滞留和释放情况。该实验流程的最后一步是检测纳米抗逆转录病毒药物在单核细胞来源巨噬细胞中的体外抗逆转录病毒效果。

最终可获得结果显示，纳米药物在细胞中具有增强的摄取效果和缓慢释放特性，并表现出强大的抗逆转录病毒疗效。这些结果通过高效液相色谱法（HPLC）测定药物浓度，以及通过检测感染培养物上清液中逆转录酶活性来确定。大家好，我是Hanta Aldi，内布拉斯加大学医学中心Howard Gelman博士实验室的一名博士后研究员。

我们提出的方法有助于回答纳米医学领域的关键问题，包括如何利用基于细胞的药物递送系统来推动转化研究工作。这可以通过使用具有延长半衰期的纳米制剂抗逆转录病毒疗法来实现。我们的研究支持将纳米抗逆转录病毒药物用于临床应用的潜力。

您好，我叫 Ari Noche，是一名在 Carol Schwartz 新兴神经科学实验室工作的医学博士（MD-PhD）项目学者。在 Gendelman 博士的指导下，我们向您展示的这些技术的应用意义延伸至抗逆转录病毒治疗领域，因为纳米制剂化合物能够同时提高药物的生物利用度和药代动力学特性，同时减少药物相关副作用。通过将临床上已有的抗逆转录病毒药物重新包装成纳米颗粒，我们或许能够提高患者的依从性，并对疾病转归产生积极影响。

您好，我是霍华德·根德尔曼（Howard Gendelman）博士。我是一名临床科学家，同时也是内布拉斯加大学医学中心药理学与实验神经科学系的教授兼主任。我们的总体目标是简化抗逆转录病毒药物，使其更易于获取，并改善其生物分布和药代动力学特性。

现在，我将把时间交给Ari和Sean，他们将带您进入研究实验室，向您展示这些纳米颗粒的制备与开发过程。在内布拉斯加大学医学中心，为了通过湿法研磨制造纳米制剂，首先称取用于制备纳米制剂的药物晶体和各种表面活性剂，并将其与10毫摩尔的Heis缓冲液（pH 7.8）混合，使用T 18 Ultra-Turax混合器搅拌至完全分散。在连续研磨过程中，制剂中药物的百分比应保持在1%至2%之间。

确保冷却器和压缩机已开启，且当前出口压力约为100 PSI。设置完毕后，将研磨介质装入罐中，并向研磨室加入50毫升珠子。使用漏斗时，确保螺纹处或研磨室外任何位置均无珠子，以避免机械密封处发生泄漏。现在，请确认O型圈已正确安装在研磨室的相应位置上。

然后选择合适的筛网孔径，并通过拧紧螺母固定盖子。筛网孔径应至少为珠粒尺寸的一半。在连续研磨过程中，应使用较大的筛网孔径，以避免产物堵塞滤网。

降低研磨室后，将含有不同量表面活性剂的药物混悬液加入产品入口。混悬液的最小体积应为100毫升。这可以防止研磨室过热，并因减少部件磨损而避免微珠污染。

接下来，启动泵。使用控制单元调节流速，以满足您制剂的要求。然后开启搅拌器，并通过控制单元调节搅拌速度。

转速可从每分钟600转提高至每分钟4,320转。在微米级表面处理过程中，通过研磨室顶部安装的温度计监测温度，确保无过热现象。随后在不同转速和流速下对样品进行研磨，并取出约一毫升的小份样品，使用马尔文泽塔粒度分析仪通过光散射衍射法测定其粒径和电荷。

达到所需粒径后，使用控制单元停止研磨，同时保持泵继续运行，将样品收集至烧瓶中，使药物完全排出。操作完成后记得关闭泵，并取出珠子进行清洗。随后将研磨后的悬浮液转移至50毫升离心管中，设置离心机以10,000转/分钟离心30分钟。

离心结束后，测量上清液的量，并加入等量的新鲜表面活性剂溶液进行替换。重悬完成后，将悬液转移至研磨室，研磨10分钟。取约1毫升的等分试样，使用Zeta电位仪再次测量样品的粒径和电荷。

最后，使用HBLC测定纳米制剂的浓度，通过均质化法制备纳米制剂。采用Avastin Emulex C五，按照先前所述方法制备药物晶体和各种表面活性剂，并将悬浮液转移至均质化容器中，开始循环。在启动样品均质化前，务必确保冷却器已开启。

逐渐增加压力，直至压力表读数达到 20,000 ± 2,000 PSI，然后继续均质化，直到达到目标粒径。此过程通常需要 45 至 60 分钟。每隔一段时间取约 1 毫升样品，使用泽塔粒度分析仪离心机测量样品的粒径和电荷，均质化悬浮液的处理方法如前所述。

然后，在重悬后，将悬液转移至C5匀浆器中。重新启动循环，并将匀浆压力调回20,000 ± 2000 PSI，匀浆30分钟，随后通过冷浴式Palmer超声处理器进行超声处理。将氯甲烷中的PLGA和药物溶液倒入1% PVA表面活性剂溶液中，并置于冰浴中超声处理。

以50%的振幅开始超声处理，但对于样品量较少的批次，可将超声振幅降低至约30%。超声处理样品10分钟。取出少量等分试样进行粒径分析。如果颗粒大小超过1.5微米，则以每2分钟为间隔继续超声处理，总时间最长不超过16分钟。

在显微镜下以20倍放大倍数观察样品，并记录观察结果。使用搅拌器形成足够的涡流以混悬样品，并在室温下持续混合过夜。24小时后收集悬液，倒入50毫升离心管中。

将样品在5°C条件下以8,000转/分钟的速度离心20分钟，倾去上清液，将一半样品重悬于75毫升过滤后的反渗透水中，另一半样品重悬于75毫升0.5%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）表面活性剂中。再次将样品在5°C条件下以8,000转/分钟的速度离心20分钟，并将每份沉淀物分别重悬于总共20毫升的甘露醇溶液中。最后，对于通过均质化或超声处理制备的颗粒，使用Zeta粒度分析仪测量颗粒大小，并采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品浓度。

为了进行显微镜观察，取制备好的纳米艺术悬浮液，以20%的振幅用超声探头超声处理10秒。取一块显微镜载玻片盖玻片，将其放置在倒置显微镜上，然后将样品滴加在盖玻片上。

取15微升纳米颗粒悬液与100微升磷酸盐缓冲液混合，通过反复吹打数次混匀。然后使用20倍物镜观察纳米颗粒的形态。样品也可制备用于扫描电子显微镜观察。

在此，我们展示了通过低电压场发射扫描电子显微镜（A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F）获得的图像，该图像是在通过离心法分离血液单核细胞后，将纯化的单核细胞以每毫升1×10⁶个细胞的浓度接种于添加了以下添加剂的DMEM培养基中，随后将每孔2×10⁶个细胞接种至6孔板中，在含5%二氧化碳的湿润环境中培养7天，以使单核细胞分化为巨噬细胞，用于后续分析细胞摄取与收集情况。将纳米颗粒（nano art）与培养基混合至终浓度为100 µmol/L，并在预定时间点或当细胞完全负载纳米颗粒时，向每孔加入1 mL处理培养基。

移除所有处理液，用一毫升 PBS 洗涤细胞三次，以去除未被细胞摄取的颗粒。使用细胞刮将贴壁细胞从孔板底部刮下，并转移至 1.7 毫升微量离心管中。随后在 4 摄氏度下以 1000 RCF 离心 10 分钟。

去除上清液，加入200 µL 100%甲醇，使细胞裂解，并通过超声探头以20%的振幅短暂超声处理2至5秒，以溶解纳米药物。将样品储存于-80 °C，直至准备进行药物含量分析。细胞内纳米药物的滞留情况也可通过透射电子显微镜观察，样品经切片机制备超薄切片后如图所示。

请参阅本文的配套文本，了解分析纳米制剂释放处理细胞的详细步骤，该步骤此前已用于分析细胞摄取和收集。然而，与洗涤后收集细胞不同的是，在指定时间点或根据培养基变黄的指示，将 PBS 替换为两毫升不含 MCSF 和纳米制剂的细胞培养基，并在所需时间点更换一半培养基。收集一毫升细胞培养基及相应的细胞重复样本，用于药物分析。

为了实时观察纳米颗粒的摄取过程，可采用共聚焦显微镜进行成像。首先取一种DRE染料（如vibrant），按照制造商说明将其加入培养基中，然后将含染料的培养基加入成熟的单核细胞来源的巨噬细胞中。随后用一毫升培养基洗涤细胞三次，以去除未结合的过量染料。接着，将荧光标记的纳米颗粒与培养基混合，并加入含有标记纳米颗粒的处理培养基。在共聚焦显微镜成像前立即开始，使用60倍物镜，每30秒拍摄一张图像，持续四小时。

最后，可进行HIV-1感染和感染性检测。首先按照前述方法处理细胞以观察病毒释放情况。随后在预定的时间点，移除全部培养基，并更换为不含M-CSF且含有HIV-1 A株、感染复数（MOI）为每细胞0.01个病毒颗粒的培养基，孵育24小时。

随后去除病毒培养基，并更换为新鲜的无病毒培养基，继续培养细胞10天，每隔一天或根据需要更换一半培养基，以确保细胞在感染后10天内保持存活。从每个孔中收集10微升培养基，加入96孔板中，于-80摄氏度保存，直至进行逆转录酶分析。后续也可进行HIV-1 p24抗原检测。

在此，我们可以清楚地观察到经纳米ART处理1天后，以0.011的感染复数暴露于病毒的细胞形态。在这些单核细胞来源的巨噬细胞中，未见病毒感染的迹象，且纳米颗粒在细胞质中清晰可见。此处，细胞在经纳米ART处理10天后暴露于病毒。

部分细胞经P24染色和多核巨细胞形成证实已被感染，但与未处理的细胞相比，仍显示出显著的保护作用。注意，在B图中细胞胞质内仍可见纳米颗粒，但其数量不及A图中所见；在未用纳米ART处理的细胞中则不存在这些结构。在这些活细胞共聚焦视频中，我们观察到巨噬细胞标记为绿色，纳米ART标记为红色。

在此我们可以观察到，这些细胞积累的纳米颗粒非常少。而在这里，细胞迅速积累颗粒，表现为红色荧光增强。这些差异与使用高效液相色谱法（HPLC）分析药物摄取时所观察到的结果一致。此外，我们还可以看到细胞主动摄取这些颗粒。

细胞摄取纳米材料速率的差异反映了纳米材料的物理特性（如尺寸、形状和电荷）对巨噬细胞摄取和保留纳米材料能力的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用湿法研磨均质化和超声处理技术制备纳米材料。这些是制备抗逆转录病毒纳米颗粒的有效方法。

湿法研磨和均质化可将较大的药物晶体颗粒在脂质表面活性剂中分裂成较小的纳米颗粒，而超声处理技术则可在聚合物中产生单个纳米级药物液滴。本文还展示了如何利用人单核细胞来源的巨噬细胞作为测试平台，评估纳米颗粒的转运特性。我们的检测方法能够简便地筛选颗粒被细胞摄取、滞留和释放的能力，以及其抑制病毒复制的潜力。

这使得研究人员能够识别出在体内最有可能取得成功、并最终用于感染患者的纳米药物。这些实验的完整结果已发表于我们的在线文章《纳米在线》中。该文章题为《纳米制剂抗逆转录病毒药物组合延长 HIV-1 感染巨噬细胞中的药物释放及抗病毒反应：对神经艾滋病治疗的意义》，发表于《神经免疫药理学杂志》2010 年。

非常感谢。