在病毒颗粒共存条件下细胞外囊泡的分离与富集

从病毒感染细胞的纯化培养上清液开始。该上清液含有细胞外囊泡（EVs），包括多种外泌体亚群和类外泌体囊泡，以及HIV病毒颗粒和宿主蛋白复合物。
取一支含有密度梯度介质的离心管，其中最高密度层位于底部，上方依次为密度逐渐降低的各层。
将EV悬液加至梯度顶部。
通过离心根据颗粒密度进行分离，使EV在特定组分中富集，同时将HIV病毒颗粒浓缩于较高密度的组分中。
随后，从每一层中分别收集等体积的组分至不同的离心管中。
向每支离心管中加入具有多孔壳结构并嵌入核心配体的水凝胶纳米颗粒。
在旋转条件下孵育，使EV进入多孔壳内，通过其表面蛋白与配体结合，并在纳米颗粒-EV复合物中浓缩。
离心以沉淀纳米颗粒-EV复合物，弃去上清液，并用缓冲液洗涤。
此时，EV富集的组分已准备好用于后续分析。
按照文中的描述，制备含11个密度梯度组分的碘克沙醇密度梯度介质，其碘克沙醇浓度范围为6%至18%。将各管涡旋混匀，并将密度梯度组分逐层加入洁净干燥的摆动桶超速离心管中。
将重悬的EV沉淀加至梯度顶部，在4摄氏度条件下以10,000 × g 超速离心90分钟。小心地将每一份组分从超速离心管转移至新的微量离心管中。通过混合等体积的NT80、NT82和1× PBS，制备用于EV组分富集的30%纳米颗粒悬液。
涡旋纳米颗粒混合物以确保均匀。向每个密度组分中加入30微升该悬液，并通过移液或倒置离心管的方式混匀。最关键的步骤是在密度梯度分离后加入纳米颗粒以浓缩EV。
若缺少此步骤，EV的回收率将显著降低。在4摄氏度条件下旋转含有纳米颗粒的密度组分过夜。然后在室温下以20,000 × g 离心5分钟。弃去液体，并用1× PBS对EV沉淀洗涤两次。