利用双腺病毒转导检测 SMAD 信号通路激活

取乳腺癌细胞培养物。

用两种腺病毒共感染。其中一种携带在组成型活性启动子驱动下的绿色荧光蛋白（GFP）基因。

另一个含有在 SMAD 响应性启动子调控下的编码红色荧光蛋白（RFP）的报告基因。

向测试培养物中加入TGF-β并进行孵育。

病毒与受体结合以进入宿主细胞，将基因递送至细胞核，并实现绿色荧光蛋白（GFP）的表达。

在测试细胞中，TGF-β 与其受体结合，并通过磷酸化 SMAD2 和 SMAD3 蛋白来激活 SMAD 信号通路。

这些蛋白质与SMAD4形成复合物。

该复合物结合至报告基因的启动子，从而在表达GFP的同时也实现RFP的表达。

在对照组中，SMAD 通路保持非激活状态，使细胞仅表达 GFP。

采集活细胞的荧光图像。

两种信号的同时存在表明通过双腺病毒转导实现了SMAD通路的激活。

腺病毒感染当天，在12孔板的每个孔中加入约1.25 × 10⁵个 MDA-MB-231 细胞和500 µL培养基，使细胞汇合度达到35%。所有孔均加入75 µL腺病毒-CMV-GFP和7.5 µL腺病毒CAGA12-Td-Tomato，以获得2,500的感染复数（MOI），可实现100%感染阳性率。随后在腺病毒感染后立即向处理孔中加入TGF-β。

在37摄氏度、10%二氧化碳条件下孵育24小时。第二天，使用相差荧光显微镜对活细胞进行成像。