感染人淋巴细胞中病毒核酸与蛋白质的多重荧光成像

从载玻片上固定的、感染了 HIV-1 的人淋巴细胞开始。

这些细胞已与荧光标记病毒RNA和前病毒DNA的探针进行杂交。

将细胞置于封闭液中孵育，以防止非特异性抗体结合。

加入靶向 HIV-1 衣壳蛋白的初级抗体。

孵育以使一抗与衣壳蛋白结合。

用缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的抗体。

加入可与一抗结合的荧光标记二抗。

洗去未结合的抗体。

加入DNA特异性染料以染色细胞核，然后洗涤以去除多余的染料。

采用多重荧光成像技术，以不同颜色同时检测病毒 DNA、RNA、蛋白质以及宿主细胞核。

这种单细胞可视化技术能够通过同时显示感染细胞中的病毒DNA、RNA和蛋白质，研究病毒生命周期的不同阶段。

针对目标蛋白的免疫染色，在最后一次洗涤后，每张盖玻片加入 200 µL 封闭缓冲液，于室温孵育 1 小时。

孵育结束后，弃去封闭缓冲液，加入200 µL用含1%牛血清白蛋白的PBST（磷酸盐缓冲液加吐温20）稀释的目标一抗。室温孵育1小时后，在每次振荡洗涤10分钟的条件下，用新鲜PBST洗涤载玻片两次，随后在室温下用合适的二抗标记样品1小时。孵育结束后，每次在振荡条件下用新鲜PBST洗涤载玻片10分钟，共洗涤两次。

第二次洗涤后，在室温下用适当的核染料对细胞核复染1分钟，随后在室温下用PBS洗涤两次，每次10分钟，并进行振荡。