一个Biomining从宏基因组库的纤维素酶的活性高通量筛选

该程序的总体目标是从宏基因组文库中鉴定表达纤维素酶的克隆。这是通过首先使用机器人复制先前制作的宏基因组文库，然后将复制的文库在 37 摄氏度下孵育 24 小时来实现的。测量大肠杆菌克隆的生长，然后将裂解、缓冲液和底物添加到复制的文库中。

最终，通过使用读板器进行比色吸光度测量，可以获得显示纤维素酶活性的结果。大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学微生物学和免疫学系 Steven Hallam 实验室的 Keith。今天，我们将向您展示宏基因组文库的高通量功能筛选程序。

我们在实验室中使用该程序来研究宏基因组文库中的生物素纤维素酶活性。那么让我们开始吧。在开始此协议之前，准备以 384 孔板格式储存的宏基因组文库。

本研究使用 PCC 单拷贝对照 SMID 载体与 Farge T 单抗性 TRANSFECT max EPI 300 T 单抗性大肠杆菌细胞作为文库宿主，开始此程序，从零下 80 摄氏度取出含有文库的板，并在 37 摄氏度下解冻约 20 分钟。同时，使用 QIX 2 上的紫外线消毒功能对机器人进行 15 分钟消毒。根据制造商的说明设置 Q 填充 3，并通过无菌管路程序将培养基瓶连接到歧管上。

Q 可填充 3 个适量的介质，并将其设置为填充 45 微升的体积。在每个装置中，使用机器人的吹扫功能清除管道和歧管中的空气，直到看到介质。在歧管的每个针脚处，使用 Q fill 3 用 LB 介质填充所需数量的板。

每个板大约需要 20 秒来填充。接下来，将文库板和新板加载到 Q picks 的适当区域。用机器人填充适当的试剂来填充清洁槽。

后槽中加入 2% micro 90，中槽中加入高压灭菌蒸馏水，前槽中加入 80% 乙醇。使用 qix two 的复制程序，选择合适的头以及源板和目标板的数量和类型。此外，将 head 设置为在复制之间进行清理。

通常每个浴池循环六次就足够了。机器的容量一次为 10 块板。将计算机设置为运行。

复制它大约需要 15 分钟。全容量，带 384 针头。复制板后，将板在 37 摄氏度下在湿度箱中生长 24 小时。

较长的孵育时间是必要的，因为添加阿拉伯糖会诱导高拷贝数的 smid。同时，按照书面协议中的说明清洁 Q fill three 机器人。孵育后，从 37 摄氏度培养箱中取出板。

将盖子放在一边，将板放在快速堆栈提供的样品盒装载平台上。请务必跟踪板的顺序，因为软件不会。将读取堆栈底部的盘子。

首先，从快速堆栈中取出一个弹匣。确保它是空的，并将其推到板堆上进行读取。抓住磁带盒的把手，板应装入磁带盒。

以正确的方向将磁带盒装入快速堆栈中。在连接的计算机上打开 scan its re 程序。选择 New session 并为其命名。

选择调用平底 384 孔板作为板。在板版布局区域中键入。选择向导按钮并选择它以将 384 个未知物添加到板中。

在协议区域中，选择 well loop（孔环）选项并输入 for 384 wells（384 孔）。井环图标将出现在屏幕左侧的流树中。选择图标，然后单击以添加光度测量。

将其设置为在 600 纳米处读取。使用唯一名称保存协议，然后关闭 scan it re 程序。然后打开 polara RS 程序。

主页上有一个表格，在 VARI 扫描标题下列出了连接到快速堆栈设备的仪器，单击运行会话选项。然后，检测窗口应出现，中间有一个流程图。选择运行会话项目，然后找到已保存扫描的名称。

它在屏幕右侧出现的下拉菜单中重新运行。选择协议后，单击 run.此检测会弹出一个框，询问使用哪个杂志作为来源，哪个杂志是空的。

屏幕上的下部框对应于正面杂志。确保快速堆栈和 Vario 扫描都已打开，然后单击 start（开始）。快速堆栈会自动将板加载到读板器中，以便对板进行连续测量。

观察 Vario 扫描中的第一个印版加载情况，以确保机器正确对齐以读取。25 块板大约需要 50 分钟。Barrios 扫描完成后，取出装满的弹匣并将其放在弹匣装载平台上。

抬起平台的外矩形，弹匣应该滑落，留下板在中间堆成一堆。最后，更换基于溶液的筛网上板上的盖子。对于纤维素活性，首先使用预制的 10 倍裂解液制备检测混合物。

按照书面方案中所述，在 pH 值为 5.5 的 50 毫摩尔乙酸钾缓冲液中混合。然后在 DMSO 中制备高达 75 毫克/毫升的显色二苯或 DNP 细胞杀菌剂底物储备液，确保底物完全溶解。将 DNP 细胞杀菌剂储备液添加到检测混合物中，最终浓度为 0.1 毫克/毫升。

请记住，每个板使用大约 20 毫升的溶液，并且需要额外的 50 毫升才能允许死体积。像以前一样，使用 Q fill 3 在分析混合物中将 Q fill 3 设置到每个板中。每个板大约需要 20 秒来填充。

添加检测混合物后，将板在 37 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。在湿度箱中，从 37 摄氏度培养箱中取出板。将盖子放在一边，以与以前相同的方式将板放在配备快速堆栈的料盒装载平台上。

打开扫描程序并像以前一样进行设置，但光度测量除外，应将其设置为在 400 纳米处读取。然后将参数输入到 POLARA RS 程序中。如前所述。

让 Vario 扫描读取板。运行后，取出并丢弃板。要导出打开的吸光度读数，请扫描 it re 软件并选择。

打开现有文件。选择保存会话的目录，然后点击 加 图标以展开列表。在标题标题下，将有标记为容器 1 到容器 N 的选项，根据板的数量，在页面顶部的菜单栏中选择要分析的第一个板，选择数据报告导出。

选择导出选项，例如板布局和光度数据。单击 view report（查看报告），然后单击 file save（文件保存）。选择所需的目录。

输出格式为 Microsoft Excel 电子表格。这里是单个 384 的吸光度读数。如图所示，含有阳性克隆的孔板与不表达纤维素酶活性的克隆相比，阳性克隆的吸光度显著增加。

测定时间、孔、板上的位置或 DNP 浓度的差异会影响绝对吸光度读数。相对吸光度读数（例如吸光度高于板平均值或柱平均值的差异）是鉴定纤维素酶阳性克隆的更可靠方法。我们刚刚向您展示了如何从宏基因组文库中鉴定纤维素酶阳性克隆。

执行此程序时，请务必记住将 DNP 细胞生物侧溶解在 DMSO 中，并在湿度室中孵育板。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。