利用病毒-Cas9系统在体外建立小鼠肿瘤细胞系

从携带由终止序列沉默的Cre依赖性Cas9基因的原代小鼠上皮细胞开始。
加入含有编码Cre重组酶、靶向癌症相关基因Kras、p53和Apc的向导RNA，以及携带致癌突变的修复模板的病毒颗粒。
将病毒颗粒加入细胞中并进行孵育。
病毒颗粒进入细胞并释放其DNA，从而启动Cre重组酶、向导RNA和修复模板的表达。
Cre重组酶切除终止序列，使Cas9得以表达。
向导RNA结合Cas9并引导其至靶基因位点，Cas9在该处切割DNA。
易错修复引入突变并使p53和Apc失活，而修复模板则修复Kras的断裂并引入致癌突变。
更换为新鲜培养基，继续孵育。
未获得突变的细胞无法获得永生化而死亡。
与此同时，携带突变的细胞持续增殖，建立起具有致瘤性的细胞系。

在培养的第10天，使用含0.2% EDTA的0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度条件下作用3至5分钟，收集细胞悬浮液或细胞聚集体培养物中的细胞，并将每2毫升培养基中接种2 × 10⁵个原代细胞，分别接种至6孔板的每个孔中。

第二天，用每毫升含1×10¹²个病毒基因组的病毒颗粒转导细胞，并在37摄氏度条件下，将细胞在含有病毒颗粒的培养基中孵育48小时。

孵育结束时，将每孔中的培养上清液更换为两毫升新鲜完全培养基，并将细胞放回细胞培养箱中。

经过两周的培养扩增后，将细胞接种用于验证及体内致瘤实验。