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微生物学
0 次观看 • 3:36 分钟 • August 31st, 2026
从含有原型泡沫病毒（PFV）整合体、单体整合酶、DNA 寡聚物和蛋白质聚集体沉淀物的悬浮液开始。
PFV 整合体是由病毒整合酶四聚体与模拟病毒基因组 DNA 的合成寡核苷酸复合而成。
向悬浮液中加入盐溶液，并在冰上孵育。盐可降低整合体之间的静电相互作用，从而使沉淀物溶解。
定期轻轻吹打，以促进整合体溶解。
离心以沉淀剩余的沉淀物，并收集含有可溶性整合体的上清液。
取一支预先用交联琼脂糖珠填料平衡好的凝胶过滤层析柱，并将上清液上样至该层析柱中。
由于其分子量较大，蛋白质聚集体和整合体可绕过层析珠的孔隙，较早地被洗脱出来。
较小的单体整合酶及寡聚体进入珠孔并较晚洗脱。
收集早期洗脱的含有整合体的组分，用于后续分析。
在洁净的表面上，使用新的剃刀或手术刀片从200微升枪头末端切下2至4毫米，制备两个宽孔枪头。将透析管从透析缓冲液中取出。为防止夹子附近管末端残留的透析缓冲液稀释整合体样品，使用带有细小枪头的微量移液器移除多余的透析缓冲液。
从此端移除透析管上的夹子。在回收组装物时，重要的是尽可能收集全部溶液和沉淀物。使用宽口移液吸头将透析管内的样品（包括沉淀物）转移至冰上的一支1.5毫升离心管中。
记录回收材料的总体积。总体积通常约为 140 µL。含有沉淀物的样品中氯化钠浓度为 200 mM。
通过加入适量的5 M氯化钠储存液，将盐浓度提高至终浓度320 mM氯化钠。将装有样品的冰桶转移至4 °C冷室。使用宽口移液吸头通过移液操作重悬并溶解沉淀物。
每20分钟重复一次，至少持续一小时。大部分沉淀应溶解于溶液中。为纯化整合体，使用排阻层析运行缓冲液以0.4毫升/分钟的流速对交联琼脂糖凝胶排阻层析（SEC）柱进行平衡。
将整合体样品在微型离心机中以 14,000 × g 在 4 °C 下离心 10 分钟，以沉淀任何残留的沉淀物。小心去除上清液后，将其加载到 200 µL 进样环中。将样品上样至 SEC 柱。
用25毫升SEC运行缓冲液洗脱，并收集95个270微升的组分。观察到SEC色谱图显示三个A280和A260峰。