用于实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析的病毒RNA提取

从在培养基中连续稀释的合成病毒RNA标准溶液开始。

这些稀释液可作为参考标准，用于定量样品中的病毒RNA。

现在，从病毒感染的细胞培养物中吸取含有病毒的上清液。

这种培养基含有可结合RNA降解酶并防止病毒RNA降解的抑制剂。

加入含有蛋白酶 K 酶的处理缓冲液。

短暂离心溶液以充分混匀。

将含有样品的PCR板放入热循环仪中。

首先，在温和温度下孵育以激活蛋白酶K。

该酶可消化包裹基因组的病毒蛋白，从而将病毒RNA释放到溶液中。

接下来，在较高温度下孵育以灭活酶并使RNA变性。

最后，将处理后的样品在低温条件下保存，直至进行实时定量 PCR 分析。

首先，将199 µL处理缓冲液与1 µL无核酸酶的蛋白酶K混合。使用细胞培养基，将制备好的登革病毒3'非翻译区（UTR）RNA按1:10比例进行系列稀释，通过重复移液和涡旋，获得浓度范围为5×10⁶至5×10³拷贝/µL的RNA标准品。取5 µL登革病毒感染细胞的培养上清液以及登革病毒3'UTR RNA标准品，分别加入A2 PCR八联管或96孔PCR板的孔中。

加入5 µL含有处理缓冲液和蛋白酶K的溶液。在200 × g下短暂离心5秒。将样品在PCR仪中于25 °C孵育10分钟，随后在75 °C孵育5分钟。