仙台病毒介导的人血细胞重编程为诱导性多能干细胞

取一培养物的人类外周血单个核细胞（PBMCs）。

加入编码重编程转录因子的仙台病毒。覆盖并密封培养板。

离心以增强病毒与细胞的接触，并进行孵育。

病毒融合后，病毒RNA表达转录因子，激活细胞多能性基因并抑制谱系特异性基因，从而启动重编程过程。

在此过程中，一部分被转导的外周血单个核细胞（PBMCs）会转化为诱导性多能干细胞（iPSCs），并表达黏附蛋白。

将它们转移至基质包被的孔中，并离心沉淀细胞。用生长培养基替换上清液。

孵育后，iPSCs 会黏附于基质上，而经转导的非黏附性 PBMCs 则保持悬浮状态。

将悬液转移至包被的孔中并离心。向原始孔中加入培养基，并将两孔一同孵育。

剩余的转导PBMCs启动重编程，转化为iPSCs并贴壁。此步骤可最大程度保留重编程细胞。

每天更换培养基以维持诱导多能干细胞的生长。

在此步骤中，将血细胞转移至15毫升锥形管中，并使用血细胞计数板进行计数。接着，为转导准备3 × 10⁵个细胞，并在室温下以515 × g离心5分钟。

随后，用吸液法弃去上清液，将细胞重悬于 0.5 毫升血液细胞培养基中。然后，将细胞转移至未经包被的 24 孔板的一个孔中。在冰上融化仙台病毒混合液，并将其加入悬浮细胞中。

用封口膜密封培养板，并在30摄氏度下以1,150 × g离心30分钟。离心后，在37摄氏度、5%二氧化碳环境中过夜培养细胞。次日，为用玻连蛋白包被24孔板，将玻连蛋白溶液用PBS稀释，得到终浓度为5 µg/mL。

接着，向一个孔中加入一毫升的玻连蛋白（vitronectin），并在室温下孵育至少一小时。之后，移除包被液，并将含有细胞和病毒的全部培养基转移至已包被的孔中。然后，用额外的0.5毫升新鲜血细胞培养基收集残留的细胞，并将其加入含有细胞的孔中。

随后，在35 °C条件下以1,150 × g离心10分钟，然后将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。进行第二次细胞转移时，按照前述方法用5 µg/ml的玻连蛋白包被孔板。每个转导使用一个孔，将细胞悬液从第一块板转移至新包被的玻连蛋白板。

同时，向第一块培养板的一个孔中加入 1 mL iPSC 培养基以进行维持培养，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，每天更换新鲜的 iPSC 培养基。转导后第 14 至 21 天将出现细胞集落。将含有悬浮细胞的新包被培养板在 35 °C 下以 1,150 ×g 离心 10 分钟。

离心后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，弃去上清液，更换为新鲜的诱导多能干细胞培养基。每天更换培养基，持续培养贴壁细胞，直至细胞融合度达到80%。