病毒DNA-蛋白质复合物中蛋白质的分离

取含有被炔基修饰核苷酸标记的病毒基因组的细胞核。

将细胞核悬浮于生物素叠氮化物和铜离子的混合液中，并进行孵育。

铜离子有助于叠氮基团与炔基之间的共价结合。

离心并弃去上清液。

用缓冲液重悬，转移后离心以收集沉淀。

速冻沉淀，然后解冻以促进裂解。

重悬并进行超声处理以裂解细胞核。

离心并收集含有蛋白质-病毒DNA复合物的上清液。

过滤上清液以去除污染物。

稀释滤液。

加入链霉亲和素包被的磁珠，孵育以促进与生物素标记的蛋白质-DNA复合物的结合。

施加磁场以收集磁珠，并进行洗涤以去除污染物。

重复洗涤步骤。

加入洗脱缓冲液并加热，以分离并变性蛋白质。

分离磁珠，收集洗脱液。

将分离的蛋白质进行速冻。储存于超低温条件下以备后续分析。

完全去除 PBS 后，用 10 毫升点击化学反应混合液重悬核沉淀物，使用 10 毫升移液器轻轻吹打 5 次。将样品在 4 °C 条件下旋转孵育 1 小时，然后按前述方法离心收集细胞核。

彻底去除点击反应混合液，然后用10毫升PBS轻轻重悬沉淀，再次离心。接着，将细胞核沉淀物小心地重悬于1毫升PBS中，并将溶液转移至1.5毫升微量离心管中。离心后，彻底去除PBS，并用液氮速冻沉淀。

此时，沉淀物可保存在 -80 °C，或继续进行后续操作。为裂解细胞核并片段化 DNA，通过吹打将解冻的细胞核重悬于 500 µL Buffer B1 中。将悬液置于冰上孵育 45 分钟。

然后，使用3毫米微尖探头，以40%的振幅对样品进行六次超声处理，每次30秒。每次超声之间将样品置于冰上至少30秒。超声处理后，样品应呈透明状，无浑浊。

在4摄氏度下，以14,000 × g离心10分钟，使细胞碎片沉淀。沉淀物体积应显著减小，将上清液通过100微米细胞滤筛过滤，并收集滤过液。然后，向滤过的上清液中加入500微升缓冲液B2。

为使生物素标记的DNA与链霉亲和素包被的磁珠结合，将300微升珠悬液转移至1.5毫升微量离心管中以制备链霉亲和素磁珠。每个样品准备一管磁珠。用1毫升缓冲液B2重悬磁珠，涡旋混匀，置于磁力架上分离磁珠，吸除洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤三次。

然后，将 900 微升样品加入已洗涤的磁珠中。剩余样品将用于输入 DNA 和蛋白质的分离。在 4 °C 下旋转孵育过夜。

第二天，将样品放入磁力微型离心管架中，去除上清液。用一毫升缓冲液B2轻轻重悬磁珠，在4摄氏度下旋转孵育五分钟，然后再次使用磁力微型离心管架去除上清液。

此时，将珠子轻轻重悬于1毫升缓冲液B3中，4摄氏度旋转5分钟。使用磁铁去除珠子混合物中的上清液后，将珠子重悬于50微升2x Laemmli样品缓冲液中，以洗脱DNA-蛋白质复合物。接下来，将样品在95摄氏度下煮沸15分钟。

在快速离心样品前，涡旋混匀混合物。将样品置于磁力架上，收集流出液并转移至新离心管中。最后，将样品速冻并保存于 -80 摄氏度。

按照文本方案中所述进行蛋白质分析。