0 次观看 • 6:10 分钟 • October 30th, 2025
取一个含有无菌人尿的多孔板。
将细菌接种至检测孔中。对照孔仅含有尿液。
取一个3D打印的、表面涂有硅胶的装置，该装置模拟导管的内表面，以用于研究导管相关性尿路感染期间生物膜的形成。
将其放入孔板中，密封后孵育。
细菌附着在装置表面，利用尿液中的营养物质形成生物膜。
用缓冲液冲洗装置，以去除松散结合的细菌。
将装置放入含有结晶紫的多孔板中，结晶紫会与生物膜相互作用并使其染色。
用水冲洗并干燥。
将装置浸入含有酸性溶液的多孔板中，以破坏染料与生物膜之间的相互作用，并使染料释放到溶液中。
使用分光光度计测量各孔中溶液的吸光度。
与对照孔相比，检测孔中更高的吸光度证实了装置上存在生物膜形成，表明该装置适用于建立导管相关性尿路感染模型。
首先，获取混合的人类尿液样本。按照指定的布局，将135微升混合人尿液分装至96孔板的每个检测孔中。
每个检测孔中加入15 µL标准化的过夜细菌培养物，使每孔终体积达到150 µL。保留至少100 µL该培养物用于后续的系列稀释验证步骤。
通过向指定的孔中加入 150 微升无菌混合人尿液来制备阴性对照孔。
现在，将插销插入对应的孔中。压下插销盖，使其与板面平齐，并用微孔板盖固定，必要时可用胶带封好。
然后将 peg 模型放入含有湿润蓝纸的密封塑料容器或袋中，以防止蒸发。在 37 摄氏度下静置培养 24 小时。
进行接种物验证时，在向96孔板第一列的第2至第6行加入保留的菌液之前，先向这些孔中各加入180微升磷酸盐缓冲液（PBS）。
现在，从第一孔吸取20微升转移至第二孔，通过上下轻柔吹打混匀。继续进行系列稀释，直至初始接种物被稀释至最后一孔。
然后，将每个稀释液分别取 10 微升点样到适当的固体培养基上，每组三个重复。在 37 摄氏度过夜培养后，计数每个点样的菌落。
进行生物膜定量时，将 peg 模型从微孔板中取出，在火焰下或生物安全柜内倒置，使 peg 朝上。弃去已使用的微孔板。
将柱盖转移至含有180 µL无菌PBS的全新微孔板中，以冲洗未贴壁的细胞。
接下来，在无菌条件下操作，将一个无菌的玻璃试管架放置在实验台上，并安装用于固定带有插钉的盖子的配套架顶。
使用微量移液器，将600微升无菌PBS分装至每个试管中。现在，将带插针的盖子插入支架，确保插针与试管对齐。移除盖子上的任何灭菌指示胶带。
使用无菌镊子将每个小柱通过瓶盖推入正下方的试管中。然后重新盖上试管盖，涡旋振荡每支试管60秒，以充分分散生物膜相关的细胞。
从每支涡旋混匀的试管中取出 100 µL，并用无菌 PBS 进行梯度稀释，操作方法同前。
为了用结晶紫对细胞进行染色，将180微升0.1%（质量/体积）的结晶紫溶液（溶于无菌蒸馏水中）加入96孔板的24个待测孔中。将清洗后的钉板模型插入对应的孔中，并在室温下孵育20分钟。
染色后，从培养板中取出 peg 模型，并丢弃使用过的培养板。在干净的容器中，用流动的自来水轻轻振荡冲洗整个 peg 模型。
再清洗两次后，将 peg 模型倒置，在室温下完全晾干。然后向新的 96 孔板中加入 180 微升 30% 乙酸。将干燥的 peg 模型插入对应的孔中。
孵育完成后，将 peg 模型从微孔板中取出。使用微孔板读数仪或分光光度计在 540 纳米处测定染色孔的光密度。