基于氯化铯梯度超速离心法纯化携带基因组的腺病毒载体

从感染腺病毒的哺乳动物细胞开始。

进行多次冻融循环以裂解细胞并释放病毒颗粒。

离心裂解液以沉淀碎片。收集含有病毒颗粒的上清液。

将病毒上清液铺在阶梯状氯化铯梯度上，进行基于密度的分离。

进行超速离心，使病毒颗粒根据其浮力密度迁移。

由于包装了DNA，含有完整腺病毒基因组的完整病毒颗粒密度更高，沉降到较低的条带，而较轻的空壳衣壳和碎片则停留在上层。

移除上层液体，收集含有基因组的病毒颗粒下层条带。

将病毒颗粒重悬于等密度的氯化铯溶液中，并再次进行超速离心，以进一步优化分离效果并浓缩完整颗粒。

弃去上层，收集下层条带。

透析样品以去除氯化铯。

高纯度且含有基因组的腺病毒载体现已可用于后续应用。

为进行氯化铯梯度纯化，需将细胞病毒悬液反复冻融四次以制备病毒裂解物。随后，在室温下以 500 × g 离心 8 分钟。

随后，收集含有高容量腺病毒的上清液。按照以下顺序，小心且缓慢地用移液器将氯化铯溶液加入离心管中：0.5 毫升 1.5 克/立方厘米溶液、3 毫升 1.35 克/立方厘米溶液以及 3.5 毫升 1.25 克/立方厘米溶液。将约 4.5 毫升澄清的病毒载体上清液覆盖在 1.25 克/立方厘米溶液层上方。

使用水平转子，在 12 摄氏度下，以 226,000 × g 的离心力在超速离心机中离心梯度液至少两小时，以将含高容量腺病毒基因组的病毒颗粒与空颗粒及细胞碎片分离。离心后，试管顶部会形成一层弥散的细胞碎片带。在此层下方，可观察到两条白色条带。

上层条带含有空颗粒，而下层条带为高容量腺病毒。小心移除细胞碎片和空颗粒层，然后从每根离心管中收集一毫升下层条带。

将病毒转移至一个无菌的50毫升离心管中。向收集的病毒颗粒中加入最多24毫升密度为1.35克/立方厘米的氯化铯溶液，并小心混匀。用密度为1.35克/立方厘米的氯化铯病毒溶液将离心管加满至顶部。

然后，在超速离心机中使用摆出式转子，于 12 摄氏度下以 226,000 × g 离心过夜，加速度和减速度均需缓慢。用移液器从顶部移除上层液体。接着，用新的移液器吸头收集存在于明显下层条带中的高容量腺病毒。

最后，对收集的病毒颗粒进行透析以更换缓冲液，然后根据书面方案中的详细说明对最终制备的病毒进行滴度测定。