利用免疫组织化学染色法验证再细胞化大鼠肝脏中的病毒转导

从嵌入冷冻介质中、含有原代人肝细胞的冷冻再细胞化大鼠肝脏组织开始实验。

在此组织中，被转导的肝细胞表达翡翠绿色荧光蛋白（EmGFP），该蛋白是由病毒载体编码的报告蛋白。

使用冷冻切片机切割能够保持细胞和组织结构的薄片，并将切片转移至载玻片上。

使用温和的去污剂处理切片，以通透细胞膜。

使用一种特异性结合转导细胞中表达的荧光报告蛋白的抗 EmGFP 一抗。

洗涤以去除未结合的抗体。

加入与红色荧光染料偶联的二抗，使其与一抗结合，随后进行洗涤。

加入一种特异性结合细胞DNA的DNA蓝色荧光染料。

在荧光显微镜下，红色荧光与蓝色染色的细胞核共定位，表明肝脏组织中被转导的肝细胞成功表达了病毒报告蛋白。

使用手术刀从每个肝叶切取约半厘米厚、1.5至2厘米长的组织样本。将组织片置于含4%蔗糖的4%多聚甲醛中，在4°C下孵育90分钟。

然后用 PBS 洗涤样品三次，每次洗涤一分钟。洗涤后，将样品在 8% 蔗糖中于 4 °C 下孵育过夜。次日，将样品放入含有固定液的冷冻模具中。

避免引入任何气泡。装载后，用固定液完全覆盖样品，并置于负80摄氏度环境中。待样品完全冻结后，使用冷冻切片机从样品中制备10微米的冷冻切片。

根据需要对样本进行染色，以确认再细胞化情况。