病毒在气液界面培养的人鼻上皮细胞中的增殖

从覆盖有黏液的人鼻上皮细胞开始，这些细胞在多孔板的Transwell小室中培养。

培养物的基底侧接触培养基，而顶端表面暴露于空气中，模拟鼻腔的气液界面。

用缓冲液洗涤培养物以去除黏液层。

将悬浮于无血清培养基中的冠状病毒加入培养物中。

将培养板置于孵育器中，偶尔轻轻摇晃，以确保病毒充分吸附。

移除病毒接种液，并用缓冲液清洗以去除未结合的病毒。

取出插入物，并用新鲜培养基补充孔板。

孵育培养板以使病毒感染进行。

冠状病毒与细胞表面受体结合，通过内吞作用进入细胞，并将其基因组释放到细胞质中。

病毒基因组进行复制并产生蛋白质，这些蛋白质组装形成新的病毒。

新病毒从顶端释放，扩散并感染邻近细胞，从而扩增病毒增殖。

在具有基底室和顶端室的transwell中培养并分化鼻腔气液界面（ALI）培养物。先在浸没条件下扩增解离的人鼻窦细胞，随后移除顶端室中的培养基，以诱导培养物在气液界面条件下分化。

感染前一天，用磷酸盐缓冲液（PBS）从顶端对ALI培养物进行清洗。操作时，向每个transwell的顶端室加入200 µL预热的PBS，将培养板在37 °C下孵育5分钟。吸除PBS后，重复清洗过程两次。

随后，每孔加入 500 微升新鲜培养基以更换底部培养基，并在预定的感染温度下过夜平衡培养物。次日，将病毒用无血清 DMEM 稀释，以在总体积为 50 微升的接种液中达到所需的感染复数。将病毒接种液从顶端加入培养物中，然后将其放回培养箱孵育 1 小时。

孵育期间每15分钟，用双手牢固握住培养板，轻轻前后及左右摇动，以确保病毒接种液均匀吸附。孵育结束后，吸除病毒接种液，并按照前述方法用 PBS 对每个感染的培养物清洗三次，以确保彻底去除残留的病毒接种液。如需要，可收集第三次 PBS 清洗液，以确认输入病毒已被充分清除。

每72小时更换一次感染的ALI培养物的基底培养基。