0 次观看 • 3:33 分钟 • August 31st, 2026
取一份人类细胞培养物。
添加编码靶向宿主 mRNA 的条件性 shRNA 的慢病毒，该 shRNA 在融合了四环素反应元件的启动子控制下表达。
慢病毒还携带编码四环素阻遏蛋白和抗生素抗性蛋白的基因，这些基因置于组成型启动子的调控之下。
孵育以实现病毒RNA向宿主细胞的递送。
RNA 转化为 cDNA 并整合到宿主基因组中。
洗涤细胞，加入培养基并孵育，以允许四环素阻遏蛋白和抗生素抗性蛋白的表达，从而获得转导细胞。四环素阻遏蛋白结合至操纵子，抑制短发夹RNA（shRNA）的表达。
洗涤，加入含抗生素的培养基，并孵育。
转导后的细胞表达抗生素抗性蛋白，使其能够在抗生素存在下被选择性存活。
向培养物中添加多西环素（一种四环素类似物）。
多西环素与四环素阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，从而启动shRNA的表达。
shRNA 被加工成 siRNA，随后装载到 RISC 中并降解靶标 mRNA。
这可生成依赖于多西环素的条件性基因敲低细胞。
为获得稳定细胞系，首先将 HCT-116 结肠癌细胞和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞接种至 12 孔板中，每孔接种 50,000 个细胞。
在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。当细胞融合度达到60-70%时，用PBS洗涤细胞，并向每个孔中加入1毫升含病毒的培养基。次日，通过抽吸小心移除含病毒的培养基。
用PBS洗涤细胞后，加入含有无四环素胎牛血清（FBS）的培养基。72小时后，再次如前洗涤细胞，并加入含有1 µg/mL嘌呤霉素的培养基，用于筛选病毒转导的细胞。通过在嘌呤霉素存在下培养细胞3至14天，完成对病毒转导细胞的筛选。
在转导病毒的细胞孔中，观察到嘌呤霉素对细胞产生部分杀伤作用。未转导病毒的细胞在嘌呤霉素存在下无法生长。
通过向嘌呤霉素抗性的 HCT-116 结肠癌细胞和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中添加含不同浓度多西环素的培养基，并培养 72 小时，验证条件性基因敲低的效率。