从转染的人肾细胞中纯化重组病毒颗粒

从含有与细胞蛋白聚集的细胞DNA的细胞裂解液开始。

加入镁离子，随后加入核酸酶，以激活细胞DNA的酶降解并破坏DNA-蛋白质聚集体。

离心以分离碎片，并收集含有病毒颗粒的上清液。

将上清液铺在不连续的碘克沙醇梯度上，浓度从上到下递增，然后用缓冲液充满离心管。

使用超速离心机根据密度分离组分。病毒颗粒聚集在高密度层与中密度层之间的界面处。

在此界面插入针头，并将病毒颗粒收集到离心管中。

加入含有稳定组分的缓冲液，以防止病毒颗粒聚集。

然后将溶液转移至装有膜滤器的离心管中。

离心以浓缩滤膜上方的病毒颗粒。

加入含有稳定剂的缓冲液，再次离心以获得纯化的病毒颗粒。

收集转染后的细胞时，使用培养基通过移液吹打使细胞脱离并悬浮，然后将细胞悬液转移至无菌的50毫升离心管中。在500 × g下离心5分钟。

然后向每根离心管中加入 5 毫升 PBS，重悬细胞沉淀，再将所有悬液合并至一根 50 毫升离心管中。在 500 × g 条件下离心 5 分钟后，弃去上清液。为纯化 AAV，将沉淀重悬于 10 毫升裂解缓冲液中。

将裂解液在 -80 摄氏度或干冰-乙醇浴中冷冻，然后在 37 摄氏度下解冻。每次冻融前，涡旋震荡裂解液 1 分钟，并重复冻融过程共三次。

接着，向解冻的裂解液中加入一毫摩尔的氯化镁。然后加入核酸酶，使其终浓度为每毫升250单位。将溶液在37摄氏度孵育15分钟，以降解DNA-蛋白质聚集体。

在 4,800 × g 和 4 °C 条件下离心样品 20 分钟，然后收集上清液。同时，为制备 17% 碘克沙醇梯度溶液，将 5 毫升 10× PBS 与 0.05 毫升 1 摩尔氯化镁、0.125 毫升 1 摩尔氯化钾、10 毫升 5 摩尔氯化钠以及 12.5 毫升密度梯度介质混合。

用水将总体积调至 50 毫升。根据文本方案配制 25%、40% 和 60% 的梯度溶液后，使用针头和注射器将 5 毫升 17% 的梯度溶液加入聚丙烯管中，随后依次加入 5 毫升 25%、5 毫升 40% 和 5 毫升 60% 的梯度溶液。

将裂解液铺在梯度液上方，然后用裂解缓冲液充满离心管，并用软木塞封口。在16摄氏度条件下，以185,000 ×g离心90分钟。

离心后，使用注射器将21号针头插入40%与60%密度层之间的交界处，收集40%病毒组分，务必完全避开25%的层面。将病毒组分与无菌的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物（即PEG-PPG嵌段共聚物PBS溶液）混合，总体积定容至15毫升。将混合液加入截留分子量为100千道尔顿的滤膜离心管中。

然后在 2,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 30 分钟。将管底的溶液倾倒出去。然后使用 PEG-PPG 将滤管补至 15 毫升。

在 2,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。重复加液和离心操作两次后，收集仍位于滤膜上方的纯化 rAAV9 病毒组分。