通过逆转录病毒转导病毒癌基因使内皮细胞永生化

取含有编码病毒癌基因和抗生素抗性基因的逆转录病毒颗粒的培养基。

离心培养基以去除细胞碎片。

收集含有病毒颗粒的上清液，并将其覆盖于内皮细胞培养物上。

孵育以促进病毒进入。

病毒RNA被逆转录为DNA，随后整合到宿主基因组中。

抗生素抗性基因可表达产生一种抗性蛋白。癌基因表达产生的蛋白能够结合调控细胞分裂的肿瘤抑制蛋白，并使其失活，从而延长细胞寿命。

更换为新鲜培养基。

再次孵育以确保病毒DNA稳定整合。

移除培养基并洗涤细胞。

加入酶解离溶液以使细胞脱离。

转移细胞悬液，离心并弃去上清液。

重悬沉淀物并将其转移至培养瓶中。

向培养基中添加抗生素。

只有表达抗生素抗性蛋白的细胞才能存活，从而筛选出由病毒癌蛋白永生化的细胞。

经过过夜培养后，收集PA317细胞培养的培养基，并在室温下以300 × g离心5分钟进行澄清。将50%汇合度的内皮细胞培养物中的EGM培养基更换为12 mL澄清后的PA317培养基，将细胞继续培养4小时。

然后将6 mL PA317培养基替换为6 mL新鲜EGM培养基，并将细胞过夜培养。之后，吸除内皮细胞培养物中的培养基，向细胞中加入12 mL新鲜EGM培养基。继续将细胞额外培养48小时。

传代培养内皮细胞时，移除培养基，并用12毫升无阳离子PBS洗涤细胞。然后加入3毫升商用酶解离溶液，于37°C孵育3分钟。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在室温下以300 × g离心5分钟。

离心成团后，将细胞重悬于新鲜EGM培养基中，并将悬液等量分入三个T75培养瓶中。每瓶培养体积调整为12毫升EGM。然后加入G418至终浓度为200微克/毫升，以筛选转导的内皮细胞。