通过荧光原位杂交确定宿主细胞中病毒RNA的分布

从一张含有已通透处理的病毒感染宿主细胞的载玻片开始，其中病毒RNA分布在细胞核和细胞质区室之间。

加入预杂交缓冲液，并在湿润条件下孵育。

缓冲液中，封闭试剂可阻断非特异性结合位点，而RNase抑制剂则失活RNase并保持RNA完整性。

移除缓冲液，加入与病毒 RNA 互补的已变性地高辛标记的寡核苷酸探针。

避光孵育以使探针与RNA杂交，随后反复洗涤。

加入固定剂以稳定探针-RNA杂交体，然后反复洗涤。加入含有去污剂的缓冲液以维持细胞通透性。

加入与地高辛结合的绿色荧光素标记的抗地高辛抗体，然后反复洗涤。

固定细胞以保存复合物，然后再次洗涤。

加入DNA结合染料以染色细胞核。反复洗涤以去除过量染料。

用盖玻片封片并密封。

在共聚焦显微镜下观察绿色荧光，以反映病毒RNA在宿主细胞核与细胞质之间的分布情况。

如上所示，经过三次 PBS 洗涤后，将样品在 PBS 中含 4% 多聚甲醛中再次固定 10–15 分钟，然后进行第二次通透处理（如上所示）。随后用铝箔覆盖载玻片，以保护荧光信号并防止光漂白。

用2× SSC缓冲液洗涤细胞，然后每张载玻片加入45微升杂交溶液。在37摄氏度湿盒中孵育1小时后，加入蒸馏水至目的反义寡核苷酸中，使变性总体积达到10微升。将寡核苷酸在95摄氏度下变性5分钟，然后每张载玻片加入35微升新鲜杂交溶液。

然后将样品置于37摄氏度的湿化室中孵育10至24小时，并用铝箔保护。次日，在室温下用2X柠檬酸钠盐溶液洗涤细胞两次，每次10分钟，随后在25摄氏度下用1X柠檬酸钠盐溶液洗涤一次，持续10分钟。

最后一次洗涤后，在冰上用预冷的含4%甲醛的PBS固定细胞10-15分钟，随后用新鲜PBS洗涤三次。接着，按演示方法对样本进行通透处理，然后在4°C条件下，用含抗地高辛-FITC和预冷的含0.1%BSA的PBS孵育一小时。孵育结束后，用新鲜PBS洗涤载玻片三次，并在4°C条件下用预冷的含4%多聚甲醛的PBS固定样本10-15分钟。

在 PBS 中清洗三次后，将载玻片置于冰上，用含有 0.4 微克/毫升 DAPI 和预冷的含 0.5% Triton-X 的 PBS 溶液孵育 15 分钟，以标记细胞核，随后再用 PBS 进行三次最终清洗。根据实验需要，使用含荧光微球的合适封片剂封片。用无菌擦拭纸除去多余的封片剂后，用多层透明指甲油将一张盖玻片密封至每张载玻片上，然后使用荧光显微镜确认实验是否成功完成。

随后可在共聚焦显微镜下成像，以630倍放大倍数，在封片后一小时至一周内采集样品的图像。