0 次观看 • 3:45 分钟 • August 31st, 2026
从表达多聚组氨酸标签病毒整合酶的细菌细胞悬液开始。
超声处理悬浮液，以破坏细菌膜并释放整合酶。
将裂解液转移至超速离心管中。
高速离心以沉淀细胞碎片，并收集上清液。
接下来，取一支装有镍离子螯合树脂的层析柱，并用缓冲液进行平衡。
将澄清的裂解液上样到柱子中。
含有组氨酸的蛋白质与镍的结合较弱，而带有聚组氨酸标签的整合酶则与镍强结合。
用缓冲液洗涤以去除未结合的蛋白质，然后加入咪唑浓度线性递增的洗脱缓冲液。
咪唑与组氨酸竞争结合镍，从而释放整合酶。
收集组分，并将等分试样转移至含有上样缓冲液的离心管中。
加热使蛋白质变性，然后上样至聚丙烯酰胺凝胶。
进行电泳并分析蛋白质条带。
鉴定含有纯化整合酶且无任何杂蛋白污染的组分，并将其合并以获得纯化的病毒整合酶。
首先将表达原型泡沫病毒整合酶的E.coli菌体沉淀冰上解冻。使用配备0.5英寸直径生物探头和0.125英寸直径锥形微尖的超声破碎仪，在冰上以30%振幅超声处理30秒。超声破碎后，将细胞样品转移至预冷的超速离心管中，在4°C下以120,000 × g离心60分钟。
离心后应有明显的沉淀，上清液可能呈黄色。将上清液转移至预冷的50毫升锥形管中。接下来，安装一根长110毫米、直径5毫米的FPLC柱，内含1.5毫升镍离子负载树脂。
首先，将层析柱连接至FPLC仪器，并上样缓冲液。仪器应实时采集电导率和280纳米处的紫外吸收（UV）数据。电导率和紫外读数应趋于稳定。
如有必要，继续用缓冲液冲洗层析柱，直至读数稳定。使用超大进样环，在流速为 0.15 毫升/分钟、最大压力限制为 0.5 兆帕的条件下，将蛋白质样品上样至层析柱。将超大进样环连接至 AKTA FPLC 系统。
洗涤柱子并洗脱蛋白质后，取初始流穿液、洗涤液以及280纳米吸光度峰 fractions 的15微升等分试样，向每个样品中加入15微升2X SDS-PAGE上样缓冲液。将样品煮沸3分钟。将每个样品的10微升以及4微升预染蛋白标准品上样至10% SDS-PAGE凝胶中。
通过凝胶电泳图谱的视觉观察，确定含有近乎纯化的原型泡沫病毒整合酶的组分。合并这些组分，并在移液时记录其体积，通常为 8 至 10 毫升。