通过噬斑实验定量假病毒颗粒

取一块含哺乳动物上皮细胞的多孔板。

制备含有冠状病毒刺突蛋白的假病毒系列稀释液。

每孔中更换为稀释的病毒悬液。

偶尔轻轻摇动，孵育，使病毒刺突蛋白结合宿主细胞受体。

移除培养基。加入含甲基纤维素的培养基，形成限制病毒扩散的半固体覆盖层，并进行培养。

病毒进入细胞并释放其RNA基因组。

RNA指导新病毒RNA和蛋白质的合成，这些成分组装成病毒颗粒并离开细胞。

释放的病毒会感染邻近细胞，形成一个称为蚀斑的透明区域。

移除覆盖物并洗涤细胞。

加入染料并振荡孵育培养板。

清洗并干燥各孔。

染料使细胞着色，而空斑保持透明。

计数每个孔中可见的空斑以确定病毒浓度。

为测定病毒滴度，将 Vero E6 细胞以每孔 6 × 10⁵ 个细胞的接种密度接种于六孔板中，过夜培养。次日，通过向七个微量离心管中各加入 900 µL 培养基，再向第一管中加入 100 µL 病毒原液，制备十倍系列稀释的病毒液。短暂涡旋混匀后，将 100 µL 稀释后的病毒液转移至下一管，每转移一次均需涡旋混匀。随后，吸除 Vero E6 细胞培养板各孔中的上清液，每孔加入 500 µL 稀释度为 10⁻² 至 10⁻⁷ 的病毒稀释液。

在细胞培养箱中孵育45分钟，期间每15分钟轻轻摇动一次，随后弃去接种液，加入覆盖液，并在34摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育48小时。孵育结束后，若需通过结晶紫染色观察噬斑，先用PBS洗涤细胞一次，然后向每孔加入2毫升0.1%结晶紫溶液。将培养板置于摇床上，室温下作用约20分钟后，用PBS轻轻洗涤每孔两次。

最后一次洗涤后，让培养板在空气中干燥至少一小时，然后按照所示公式计算每孔病毒滴度，单位为每毫升空斑形成单位。