使用患者血清对表达冠状病毒刺突蛋白的假病毒进行抗体介导的中和

取一块多孔板，其中测试孔含有经热灭活的、包含冠状病毒特异性抗体的患者血清。同时以健康人血清作为对照。

将表达冠状病毒刺突蛋白并携带绿色荧光蛋白编码 RNA 的假病毒加入血清样本中，孵育。

在检测孔中，抗体与刺突蛋白结合并中和假病毒；而在对照孔中，非特异性抗体不与刺突蛋白结合，假病毒保持未结合状态。

将混合物加入上皮细胞单层中。孵育以进行病毒吸附。

向每个孔中加入半固体覆盖培养基以限制病毒扩散。孵育。

在对照组中，未结合的假病毒会与细胞受体结合，进入细胞，释放RNA，并表达GFP，形成荧光感染灶。

在检测孔中，抗体中和的假病毒无法进入细胞，从而阻止感染灶的形成。

在荧光成像仪下计数荧光感染灶。

与对照组出现大量感染灶相比，检测孔中无感染灶表明患者血清通过抗体介导中和了假病毒。

进行中和试验的细胞铺板时，使用多通道移液器将 100 µL Vero E6 细胞以每毫升 2 × 10⁵ 个细胞的密度加入 96 孔板的每个孔中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。次日，在 56 °C 水浴中将待测的患者血清样本热灭活 30 分钟。

然后，在一个空的96孔组织培养板中，通过在A行的每个孔中加入8微升血清和72微升含抗生素的无血清DMEM，对患者的血清样本进行10倍系列稀释。随后，向B至G行的每个孔中加入40微升无血清DMEM，向H行的每个孔中加入80微升无血清DMEM。使用12通道多通道移液器混匀A行中的样本，然后将A行每孔中的40微升样本转移至B行对应孔中。混匀后，依次对后续各孔行进行相同稀释操作，直至F行。接着，向A至G行的每个孔中加入40微升VSV刺突蛋白EGFP病毒，感染复数为0.05，并通过上下吹打4到5次混匀，随后将培养板在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，小心吸去Vero E6细胞培养板每个孔中的上清液，将样本稀释板中每孔的60微升抗体-病毒混合物转移至细胞培养板的对应孔中。当所有样本转移完成后，将细胞培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育1小时，每20分钟轻轻摇动一次。

孵育完成后，向细胞培养板的每个孔中加入 140 µL 羧甲基纤维素覆盖溶液，并将该板转移至 34 °C、5% CO2 的培养箱中。24 小时后，在 488 nm 波长下使用自动荧光成像仪对板进行成像，并利用成像仪的自动计数功能对单个 EGFP 焦点进行定量分析。