利用荧光报告基因监测痘苗病毒中阶段特异性基因表达

从含有经重组痘苗病毒感染的哺乳动物细胞的多孔板开始。

该重组病毒编码绿色、红色和蓝色荧光蛋白，每种蛋白分别由阶段特异性启动子调控，用于追踪基因表达的早期、中期和晚期阶段。

病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，并将其病毒核心释放到细胞质中。

病毒核心中的转录机制驱动早期基因表达，表现为绿色荧光。

早期蛋白介导病毒基因组脱壳，将病毒DNA释放到细胞质中，在此处DNA聚合酶复制病毒基因组。

接着，中间基因表达（以红色荧光指示）产生激活晚期基因所必需的转录因子。

随后，晚期基因表达（以蓝色荧光指示）产生形成成熟病毒粒子所必需的结构蛋白。

加入固定剂并短暂孵育以保存荧光。

移除固定剂，然后加入缓冲液。

使用分光光度计测量荧光，以定量感染细胞中病毒基因的阶段特异性表达。

首先，从10厘米培养皿中解离培养的HeLa细胞。将细胞用生长培养基稀释至约2.0 × 10⁵ 个细胞/毫升。然后，向黑色壁、透明平底96孔板的每个孔中加入100 µL细胞悬液。将细胞在37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育24小时，直至形成融合单层。为稀释病毒，将TrpV和PLV置于37 °C水浴中解冻，随后超声处理5分钟以分散病毒颗粒。接着，将病毒原液用已预热至37 °C的感染培养基稀释至1.0 × 10⁷ PFU/mL。

用50微升稀释后的病毒替换每个孔中的生长培养基以感染细胞。每种处理分别用TrpV感染三个复孔，另用PLV感染三个复孔，以校正每种处理特异的背景荧光。在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育18小时。次日，向每个孔中已有的感染培养基中加入100微升8%多聚甲醛以固定细胞。将培养板在室温下避光孵育15分钟。

将两倍浓度（2×）或 8% 的多聚甲醛直接加入感染培养基中，可防止病毒气溶胶化，否则若在固定前直接将未固定的病毒培养基倾倒至废液皿中，可能产生气溶胶。15 分钟后，通过将培养板倒置入废液皿中去除固定液。然后每孔加入 100 微升室温 PBS，并用光学透明粘性封膜密封培养板。若培养板不会立即检测，请将其在 4 摄氏度保存。检测前务必让密封的培养板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计的测量结果。为定量病毒增殖，使用分光光度计测量终点荧光值。每孔采集四个测量值，并针对每个通道采用优化的增益设置。