在哺乳动物细胞中生成重组慢病毒

从低血清培养基中的哺乳动物细胞培养开始。

将DNA-脂质复合物加入细胞中。

该复合物包含慢病毒包装质粒和一个编码目的基因的表达质粒。

孵育以促进复合物进入细胞。

更换培养基以去除残留的转染试剂，并继续培养。

在细胞内，质粒DNA进入细胞核，指导合成携带目的基因以及病毒组分（包括衣壳蛋白、包膜蛋白、逆转录酶和整合酶）的病毒RNA。

这些组分组装成从宿主膜出芽的重组慢病毒颗粒。

收集含有释放的病毒颗粒的培养基。

离心以沉淀细胞碎片，并过滤病毒上清液以去除残留污染物。

高速离心以沉淀完整的病毒颗粒。

弃去上清液，将病毒沉淀重悬于少量新鲜培养基中。

将浓缩的重组慢病毒于低温保存，用于后续实验。

开始制备浓缩慢病毒时，将1.5 × 10⁶个HEK-293T细胞接种至60毫米培养皿中，并在含5%二氧化碳的湿润培养箱中，于37 °C下用正常培养基培养细胞。培养24小时后，当HEK-293T细胞融合度达到80%–90%时，更换为3.5 mL DMEM培养基，然后在含5%二氧化碳的湿润培养箱中，于37 °C继续孵育2小时。从培养箱中取出细胞后，更换为含2% FBS的DMEM培养基，并将新配制的转染复合物混合液逐滴加入细胞中。

轻轻混匀液体混合物。8小时后，更换细胞培养基，加入3.5 mL正常培养基。分别在24小时和48小时收集病毒上清液。

接着，混合在两个不同时间点收集的病毒上清液，并在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。然后将收集的上清液通过0.45 µm滤器，滤液收集至50 mL无菌锥形管中。在4 °C条件下以6,000 × g离心过夜，浓缩过滤后的病毒上清液。

操作完成后，确保锥形管底部可见病毒沉淀。缓慢倒出上清液。用P1000微量移液器将病毒沉淀溶解于正常培养基中，所用培养基体积为病毒上清液体积的1/100，轻轻吹打直至获得均匀的100倍浓缩病毒混合液。将浓缩后的病毒分装至微量离心管中，于−80 °C保存。