通过microRNA模拟物介导的基因组沉默评估病毒传播抑制

从人上皮样细胞开始。

第一个孔包含未转染的细胞，第二个孔包含转染了microRNA模拟物的细胞。

在转染的细胞中，microRNA 模拟物链与蛋白质复合物结合，形成RNA诱导的沉默复合物。

吸去培养基，加入病毒悬液。

孵育以使病毒吸附。

弃去培养基，加入新鲜培养基，然后继续培养。

在未转染的细胞中，病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞。

它释放出病毒基因组，该基因组进行复制并产生大量病毒颗粒。

在转染的细胞中，RNA诱导的沉默复合物识别病毒基因组，触发其降解，从而减少病毒的产生。

新病毒被释放。转移含有病毒的培养基。

离心以沉淀碎片，并收集含有病毒的上清液。

将上清液加入未转染的细胞中。孵育以进行病毒感染。

与转染microRNA模拟物的细胞上清液处理的孔相比，未经转染的细胞上清液处理的孔显示出更高的细胞死亡率，证实了microRNA介导的病毒复制抑制作用。

在此步骤中，将易感细胞接种于96孔组织培养板中，使其在转染时达到80%至90%的融合度。随后，将转染试剂升温至室温。通过在每孔中加入9 µL无血清培养基、200 nM microRNA模拟物原液、0.18 µL增强试剂和0.18 µL转染试剂，配制总混合液，并混匀。

将混合物在室温下孵育2至5分钟。随后，吸去各孔中的培养基，并加入92 µL新鲜完全培养基。然后，将适量的转染混合物逐滴加入细胞中，在37 °C下孵育6小时。

如有必要，microRNA 模拟物转染可在感染前孵育 24 小时，以提高转染效率。

接下来，用无血清培养基稀释病毒储备液。吸除培养基，每孔加入 100 µL 病毒稀释液。随后，将细胞在 37 °C 下孵育 2 小时。2 小时后，吸除每孔中的培养基，并加入 100 µL 新鲜完全培养基。然后，将细胞在 37 °C 下孵育 20 至 22 小时。

为测定上清液中的病毒滴度，收集每个孔中的上清液，并加入 100 µL 新鲜完全培养基进行替换。随后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，去除收集的上清液中的细胞碎片。然后将澄清后的上清液转移至新的离心管中，并在不表达相应 microRNA 的易感细胞上滴定感染性病毒。