病毒编码双特异性T细胞衔接分子免疫调节活性的评估

从一个含有表达靶抗原的基因修饰肿瘤细胞的测试孔和一个不含该抗原的肿瘤细胞对照孔开始。

取一种由病毒转基因编码的双特异性T细胞衔接蛋白（BTE），其具有两个结合位点，分别针对目标抗原和T细胞特异性受体。

将BTE和T细胞加入孔板中并进行孵育。

在测试样本中，双特异性T细胞衔接分子（BTE）连接肿瘤细胞与T细胞，激活T细胞释放细胞毒性颗粒。

这会裂解肿瘤细胞，释放出胞内酶。

在对照中，双特异性T细胞衔接分子（BTE）仅与T细胞结合，避免肿瘤细胞裂解。

离心并收集上清液。

加入底物并孵育。

该酶将底物催化为红色产物。

加入终止液并测定颜色强度。

检测样本中信号强度更高，证实了双特异性T细胞衔接分子（BTE）具有靶标特异性的免疫调节活性。

为评估双特异性T细胞衔接分子（BTE）诱导的乳酸脱氢酶（LDH）释放介导的细胞毒性，首先分离病毒感染靶细胞所表达并分泌的转基因产物，并按文中所述方法分离免疫效应细胞。随后将靶细胞接种于U型底96孔板中，并按文中所述设置相应样本。向各样本中加入先前已分离的免疫调节剂，浓度按实验设计确定。按所需效靶比加入免疫效应细胞，并添加培养基至每孔总体积为100微升。于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育预先确定的适当时间。

以 250 × g 离心 4 分钟。将每个孔中的 50 µL 上清液转移至平底 96 孔板的孔中，注意避免转移细胞。

根据制造商说明配制底物溶液后，向每孔加入50微升。室温避光孵育30分钟，或直至T-max样品变为深红色。孵育结束后，向每孔加入50微升终止液。

在4000 × g下离心1分钟，然后使用空心针去除气泡。在490纳米处测量光吸收值，并按照文稿中所述进行计算。