基于荧光的单个病毒颗粒分选用于基因组分析

取含有多种病毒的混合悬液，其中可能包含缺乏核酸的缺陷型病毒颗粒等污染物。

这些病毒预先用核酸结合型荧光染料进行染色，以区分含有基因组的病毒与污染物。

将悬浮液通过荧光激活细胞分选仪，对每个颗粒的光散射和荧光强度进行分析。

光散射信号反映颗粒大小，而荧光强度则指示核酸含量。

排除无荧光的污染物以及荧光异常增强的聚集体。

选择含有基因组的单个病毒颗粒，并将其直接分选到涂有琼脂糖的腔室载玻片上以实现固定。

用额外的琼脂糖覆盖每个孔，以包埋病毒。

这些样品现已准备好进行单病毒基因组扩增与分析。

使用配备定制前向散射光电倍增管（FSC-PMT）的流式细胞仪对病毒进行分选。首先将病毒颗粒稀释于0.1微米过滤的Tris-EDTA溶液中。对于含有T4和λ噬菌体颗粒的混合样品，将FSC-PMT设为1000，SSC设为200，以最大化信噪比。

运行完对照样品后，取约100微升染色后的病毒悬液，收集至总计5,000个事件。然后利用SYBR Green I与FSC-PMT散点图，在病毒颗粒中心设置一个紧密的门控。接着，向聚四氟乙烯（P-T-F-E）显微镜载玻片的每个孔中加入5微升已冷却至37摄氏度的1%低熔点琼脂糖（溶于TBE缓冲液），随后将载玻片装入流式细胞仪，以捕获分选的病毒颗粒。

开始分选，将部分孔中的病毒颗粒事件数分选至10个或以上，以利于共聚焦激光扫描显微镜观察时对病毒深度的检测。分选完成后，从流式细胞仪上取下载玻片，并向每个孔中再加入5 µL已冷却至37 °C的低熔点琼脂糖，以包埋病毒颗粒。