基于阿米巴的环境水样中巨型病毒富集方法

取一个含在饥饿培养基中培养的阿米巴原虫的多孔板。

饥饿培养基含有抗生素和抗真菌剂，可在保持阿米巴活性的同时抑制其增殖或形成休眠包囊，同时限制微生物生长。

取一支含有环境水样的试管，涡旋振荡以使病毒从悬浮固体和碎屑中释放出来。

将含有病毒的水样加入到 amoebae 中。

将培养板放入含有湿纱布的袋中以防止蒸发，并进行孵育。

孵育期间，变形虫通过吞噬作用吞噬巨型病毒。

被吞噬后，病毒将其基因组释放到变形虫的细胞质中。

在病毒基因组周围会形成一个细胞质内的病毒工厂，病毒利用宿主的复制机制进行基因组复制并合成病毒蛋白，这些蛋白随后组装成新的病毒粒子。

这会导致阿米巴细胞变圆并裂解，将新的病毒粒子释放到培养基中，从而富集用于后续检测的巨型病毒。

按照文本方案采集污水样本后，将 amoebae 加入 75 平方厘米的细胞培养瓶中，加入 30 毫升蛋白酶-蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖（PYG）培养基，于 28 摄氏度培养 48 小时，以制备宿主细胞 V. vermiformis。使用计数载片对 amoebae 进行计数，当其浓度达到每毫升 5 × 10⁵ 至 10⁶ 个细胞时，以 720 × g 离心 10 分钟收集细胞。

吸除上清液，加入30毫升无菌Page氏阿米巴生理盐水（PAS），重悬阿米巴沉淀。沉淀经第二次洗涤后，用30毫升含有抗生素和抗真菌剂的饥饿培养基重悬细胞，使阿米巴浓度约为每毫升10的6次方个。饥饿培养基可使阿米巴保持存活状态，同时避免其包囊化或增殖。

接下来，将200微升的阿米巴虫接种至96孔平底板的各孔中，在30摄氏度下孵育30分钟。然后，在室温下将水样涡旋震荡1分钟后，取每份样品25微升接种到阿米巴细胞上，留出两个孔不加样品作为阴性对照。为防止蒸发，将含有初代培养物的板放入带有湿纱布的袋中，并将此湿润环境中的培养板置于30摄氏度的培养箱中。

首次接种三天后，将初代培养板接种至新鲜的96孔板中的阿米巴细胞上，方法如前所述，无需进行显微镜观察。在30摄氏度下培养三天。然后，利用该传代培养物，按前述方法接种第三块培养板，并继续培养两天。