通过荧光显微镜定量感染性丙型肝炎病毒

从含有丙型肝炎病毒的哺乳动物细胞培养上清液开始。

用生长培养基对病毒悬液进行连续稀释。

将每个稀释度接种到肝癌细胞单层上，并进行培养。

病毒进入细胞，释放其基因组，并表达病毒蛋白，包括非结构复制蛋白。

这会产生新的病毒颗粒，出芽并感染邻近细胞，形成感染细胞的病灶。

孵育后，移除培养基并加入固定剂。在低温下孵育以固定细胞并通透细胞膜。

洗涤并加入封闭缓冲液，以防止非特异性抗体结合。

加入可结合非结构复制蛋白的初级抗体。

洗涤以去除未结合的抗体。

然后，加入与一抗结合的荧光素标记二抗。

再次洗涤以去除未结合的抗体。加入DNA结合染料对细胞核进行染色。

在荧光显微镜下观察并定量荧光灶，以确定上清液中的病毒浓度。

使用96孔板，将 naive Huh-7.5.1 细胞以每孔约 3 × 10³ 个细胞的密度接种。次日，用生长培养基对从 HCV RNA 转染细胞中收获的无细胞培养上清液进行10倍系列稀释，并以每组三个复孔接种至 Huh-7.5.1 细胞上。感染后72小时，使用甲醇在 -20 °C 下固定细胞30分钟。将细胞从冷冻环境中取出后，按照先前所述条件对 HCV NS5A 蛋白进行免疫染色。使用荧光显微镜，在病毒稀释度最高的孔中计数 NS5A 阳性细胞病灶，并计算每毫升中平均焦点形成单位（focus forming units, FFU）的数量。