使用内源性野生型BRCA1基因的细胞表达，确定同源重组的BRCA1基因突变的影响
February 17th, 2011
我们提供了一个用于测试在一个组织文化同源重组修复DNA损伤的检测消耗使用RNA干扰细胞内源性BRCA1蛋白和替换它与BRCA1基因点突变，其中包含一个编码变化的BRCA1基因变体的方法。
以下实验的总体目标是使用体外同源重组测定法测试 BRCA one 蛋白中的特异性变异。这是通过转染 BRCA one 特异性短干扰 RNA 和用于将测试 BRCA one 变体蛋白重新表达测试 BRCA one 变体蛋白的质粒作为第二步，短干扰 RNA 和表达突变型 BRCA one 的质粒被 RET 切除，除了表达 ISCE one 蛋白的质粒外，还切除了短干扰 RNA 和表达突变 BRCA one 的质粒， 这会导致测试细胞 DNA 基因组中特定位点的 DNA 损伤。接下来，将细胞孵育 2 到 3 天，以允许 DNA 损伤和修复发生，获得结果，显示 BRCA one 蛋白的特定蛋白质变体是否通过基于表达 GFP 的细胞的流式细胞术分析的同源重组在 DNA 修复中发挥作用。
该技术结合了两种既定方法，以创建一个多功能系统，用于分析通过同源重组修复 DNA 损伤的特定蛋白质变体。与现有方法相比，该技术的主要优点是，先前建立的方法依赖于具有 BRCA 基因敲除的细胞系。我们使用源自 HELOC 细胞的更易于管理的细胞系，该细胞系能够通过内源性蛋白质的 RNA 干扰来去除 BRC 一次，并在这些细胞中添加测试蛋白。
现在表达一个变体 BRC one 蛋白，我们可以测试同源重组。通常，由于手术过程中细胞死亡过多，刚接触这种方法的人会很挣扎。重要的是要仔细设置横断条件，以最大限度地提高重组反应的效果，同时限制细胞毒性。
在该方案开始之前，通过用 P-D-R-G-F-P 横切 hela 细胞来建立 hela DR 13 九细胞系将细胞系维持在 pur mycin 中的 10 厘米培养皿上，以选择稳定转染的细胞。P-D-R-G-F-P 质粒和稳定转化体中的重组底物包含 GFP 的两个无活性等位基因。由于 ISCE one 包含 18 个碱基对限制性内切酶识别位点，因此一个等位基因失活。
在其编码序列中，ISCE 的表达 ONE 在失活 GFP 的第二个等位基因上产生双链 DNA 断裂或 DSB。其序列中与第一个等位基因上的 I SCE E 一个位点相关的部分是野生型。第二个 GFP 等位基因可以作为 DSP 同源重组修复的序列供体发挥作用，并会产生活性 GFP 等位基因，在第一次转染前一天很容易通过流式细胞术检测到。
取一个 10 厘米的 hela DR 13 培养皿，其中 9 个细胞至少为 90% 汇合，胰蛋白酶在 1 毫升中观察细胞，持续 2 到 3 分钟。通过添加 9 毫升 D-M-E-M-F-B-S 终止反应，并通过移液充分混合细胞悬液。在 0.5 毫升 D-M-E-M-F-B-S 中，每 24 孔板加入 40 微升胰蛋白酶化细胞，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞过夜。
第一天，细胞的汇合度应在 40% 到 50% 之间。通过在最佳培养基中混合 irna 以耗尽内源性 b RCA one 和表达 B RCA one 突变体的质粒来开始转染。然后将核酸与 lip 混合在最佳培养基中。
转染后，按照制造商的说明进行脂质切除术转染。将细胞放回去孵育。4 到 6 小时后，用不含抗生素的培养基更换培养基。
第二天将细胞放回孵育过夜。胰蛋白酶是通过向每个孔中加入 0.3 毫升 trip le 胰蛋白酶试剂，在 37 摄氏度下短暂孵育后，通过在胰蛋白酶试剂中上下吹打细胞来松动细胞。胰蛋白酶完成后，将细胞从 24 孔板转移到含有 2 毫升 D-M-E-M-F-B-S 的 6 孔板中，以终止 tripsin 活性。
让六孔板在与初次转染后两天相同的条件下孵育过夜。在 62.5 μL Optum 中制备 SIR A、表达血浆 DNA 的 BRCA 突变体和表达质粒的 ISCE 突变体。将此溶液与 2.5 微升 LIPECTOMY 2060 2.5 微升 Optum 混合。
孵育 4 至 6 小时后继续转染细胞。用缺乏抗生素的 D-M-E-M-F-P-S 替换培养基。在第 6 天将细胞放回培养箱中。
胰蛋白酶是每个孔中加入 0.5 毫升 trip e 胰蛋白酶试剂的细胞。加入 2 毫升 D-M-E-M-F-B-S 终止反应，在室温下以 1000 RPM 离心 5 分钟收集细胞。将细胞重悬于一毫升新鲜的 D-M-E-M-F-B-S 中，分析每孔 10， 000 个细胞的 GFP 表达。
通过流式细胞术，使用前向和大小散射参数对单个活细胞进行门控。使用 GFP 荧光检测器定向 GFP 阳性细胞，结果以直方图表示。剩余的细胞可以通过荧光重新接种以进行摄影。
所需 BRCA 1 的显微镜检查通过同源重组调节双链 DNA 断裂的修复途径。那些通过同源重组进行修复的细胞很容易被荧光显微镜检测到。RNAi 耗竭 BRCA one 导致检测到的 GFP 阳性细胞急剧减少。
FCA 的输出是一个直方图，x 轴上是每个细胞的 GFP 强度，Y 轴上是细胞数。在没有转染的情况下，I SCE 一个表达质粒。未检测到 GFP 阳性细胞。
第 2 列至第 6 列的结果均取自第 3 天转染表达 ISC 1 质粒的细胞。在单个实验的典型结果集中，15.5% 的细胞在 I SCE 1 表达后为 GFP 阳性，并通过比较 BRCA 1 的耗竭并添加空质粒载体来控制不相关基因的 RNAi 耗竭。将 GFP 转化率降低至 0.7%添加外源野生型 BRCA，通过获得 15% 至 16% GFP 阳性细胞检测到一种完全恢复的同源重组。
同样，另一种意义未知的变体的表达。BRCA 一 I 21 B 突变完全恢复。BRCA 一个依赖性同源重组函数将 BRCA 一个 M 18 T 突变体加回具有与载体对照相似的效果。
由于该变体的表达水平与内源蛋白相似，因此表明 BRCA one M 18 T 变体在同源重组中无功能。在尝试此过程时，重要的是要记住监测细胞的生长，细胞生长缓慢且浓度低，并且必须减少使用的转染混合物的量。及时去除转染培养基也很重要。
我们发现，在转染后的几天里，如果培养基中含有抗生素，则会产生大量的细胞毒性。因此，第一天后的所有培养基都缺乏 抗生素 在其开发之后。这项技术为乳腺癌研究领域的研究人员在癌症诊所中探索临床意义未知的 BRC one 变体的遗传学铺平了道路。
我们希望这项工作中开发的功能性 BRC one 检测将能够更好地预测 BRC one 变体对癌症易感性的影响。
概述
本研究提出了一种使用体外同源重组测定法来测试BRCA1变异的方法。该方法涉及耗尽内源性BRCA1蛋白并用特定点突变体替换它，以评估其在DNA修复中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- BRCA1对于DNA损伤的同源重组修复至关重要。
- 现有的方法通常依赖于基因改造的细胞系。
- 本研究利用了一个更易于管理的细胞系来耗尽BRCA1。
- RNA干扰（RNAi）被用来减少内源性BRCA1水平。
研究目的
- 评估特定BRCA1变异在DNA修复中的功能性。
- 开发一种用于分析BRCA1突变的通用测定法。
- 改进现有依赖于敲除细胞系的方法。
使用的方法
- 将短干扰RNA（siRNA）和质粒转染到细胞中。
- 使用流式细胞术分析GFP表达作为DNA修复的标记。
- 孵育细胞以允许DNA损伤和修复过程。
- 建立稳定的细胞系以获得一致的实验结果。
主要结果
- 成功检测到GFP阳性细胞表明有效的同源重组。
- BRCA1的耗尽导致GFP表达显著降低。
- 结果表明所测试的BRCA1变异在DNA修复中的功能性。
- 流式细胞术提供了修复效率的定量分析。
结论
- 该方法允许有效测试BRCA1变异在DNA修复中的作用。
- 利用易于管理的细胞系提高了实验的可行性。
- 这种方法可以应用于进一步研究BRCA1相关的突变。
常见问题
Executive Industry Relevance
Functional assessment of BRCA1 missense mutations is critical for de-risking target validation and improving predictive confidence in DNA repair pathway modulation. This homologous recombination assay enables direct evaluation of variant functionality in a controlled, endogenous-protein-depleted system, supporting robust decision-making at the discovery and translational inflection points. The approach enhances portfolio triage by distinguishing functional from non-functional BRCA1 variants relevant to oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of BRCA1 variant impact on homologous recombination repair.
- Supports functional target validation by isolating variant-specific effects in a wild-type background.
- Facilitates predictive confidence in variant classification for downstream therapeutic strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated cellular system for quantitative assessment of DNA repair activity via GFP readout.
- Standardizes assay conditions by acute depletion and add-back, minimizing compensatory adaptations.
- Enables reproducible, flow cytometry-based quantification suitable for comparative screening of multiple variants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional variant data with translational biomarker strategies in oncology research.
- Supports continuity from discovery-stage variant assessment to preclinical model selection.
- Reduces biological risk by clarifying variant function prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative functional assessment of BRCA1 variants, informing both target validation and lead prioritization decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on variant-driven DNA repair mechanisms and pathway integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative GFP-based outputs for variant comparison.
- Analytics: Provides flow cytometry histograms and percentage GFP-positive cells as actionable readouts.
- Translational Research: Bridges variant function data to biomarker and model system selection in oncology.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other genes requiring recessive functional analysis in cellular systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant function and target validation.
- Operational Value: Standardizes variant assessment, reducing confounding from compensatory mutations.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for variant-driven therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of BRCA1 and related DNA repair targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNAi, plasmid transfection, and flow cytometry analysis.
- Demands access to stable cell lines and analytical cytometry infrastructure.
- Necessitates careful optimization of transfection conditions to minimize cytotoxicity.
- Standardization across teams is essential for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other gene targets may require protocol modifications supported by functional readouts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Preparation of Cell Line with an Integrated Recombination Substrate
3:04
Transfection to Deplete Endogenous BRCA1 and add back Mutant BRCA1
5:19
Analysis of Transfectants
6:07
Analysis of the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination via GFP-Expression
7:54
Conclusion
