利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

以下实验的总体目标是利用体外同源重组实验检测BRCA1蛋白的特定变异体。该目标通过以下步骤实现：首先，将针对BRCA1的短干扰RNA（siRNA）以及用于重新表达待测BRCA1变异体蛋白的质粒共转染入细胞，以替换内源性的野生型BRCA1蛋白；作为第二步，除上述短干扰RNA和表达突变型BRCA1的质粒外，还需共转染一个表达ISCE1蛋白的质粒，后者可在测试细胞基因组DNA的特定位点诱导DNA损伤。随后，将细胞孵育两至三天，以允许DNA损伤与修复过程的发生。最终通过流式细胞术分析表达GFP的细胞，获得结果，从而判断BRCA1蛋白的特定变异体是否具有通过同源重组参与DNA修复的功能。

该技术结合了两种已建立的方法，从而构建了一个多功能系统，用于分析同源重组修复DNA损伤过程中特定蛋白质变体的功能。与现有方法相比，本技术的主要优势在于，以往的方法依赖于BRCA1基因敲除的细胞系，而我们采用了一种更易操作的细胞系，该细胞系源自HELOC细胞，可通过RNA干扰技术敲低内源性BRCA1蛋白，并在这些细胞中回补测试蛋白。

现在表达一种BRC1蛋白的变异体后，我们可以检测同源重组。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到操作过程中细胞死亡过多的问题。因此，必须仔细设置转染条件，在最大化重组反应效果的同时，尽量减少细胞毒性。

在本方案开始之前，已通过将 P-D-R-G-F-P 质粒转染至 HeLa 细胞中，建立了 HeLa DR13-9 细胞系。使用嘌呤霉素在 10 厘米培养皿中维持该细胞系，以筛选稳定转染的细胞。P-D-R-G-F-P 质粒及稳定转染子中的重组底物包含两个失活的 GFP 等位基因。其中一个等位基因因插入了 18 个碱基对的限制性内切酶 ISCE1 识别位点而失活。

在其编码序列中，ISCE1 在这些细胞中的表达会在非活性 GFP 的第二等位基因上产生一个双链 DNA 断裂（DSB）。该序列中与第一等位基因上的 I-SCEI 位点相对应的区域为野生型。这个第二 GFP 等位基因可作为同源重组修复 DSB 的序列供体，从而产生一个有活性的 GFP 等位基因，可通过流式细胞术在首次转染前一天轻松检测到。

取一个10厘米培养皿，内含至少90%融合的HeLa DR139细胞，加入1毫升胰蛋白酶溶液，消化2至3分钟。加入9毫升含胎牛血清的DMEM培养基终止反应，并通过移液充分混匀细胞悬液。将40微升胰蛋白酶消化后的细胞加入24孔板的每孔中，每孔含0.5毫升含胎牛血清的DMEM培养基，于37°C及5%二氧化碳环境中过夜培养。

第一天，细胞融合度应介于40%至50%之间。开始转染时，将用于敲低内源性b RCA one的irna与表达B RCA one突变体的质粒共同加入最适培养基中混合。随后将核酸与lip在最适培养基中混合。

转染后按照制造商的说明进行脂质体转染操作。将细胞放回培养箱继续孵育。4至6小时后，更换为不含抗生素的培养基。

第二天将细胞放回培养箱中过夜孵育。在37摄氏度短暂孵育后，向每个孔中加入0.3毫升三联胰蛋白酶试剂，通过反复吹打使细胞在胰蛋白酶试剂中解离。一旦完成消化，立即将细胞从24孔板转移至含有2毫升D-M-E-M-F-B-S的6孔板中，以终止胰蛋白酶活性。

将六孔板在与初次转染后两天相同的条件下孵育过夜。在62.5微升Opti-MEM中配制SIR A、表达BRCA1突变型的质粒DNA以及表达ISCE1的质粒。将该溶液与2.5微升Lipofectamine 2000和2.5微升Opti-MEM混合。

在孵育四到六小时后，进行细胞转染。将培养基更换为不含抗生素的D-M-E-M-F-P-S培养基。在第六天将细胞放回培养箱中继续培养。

通过向每个孔中加入0.5毫升胰蛋白酶试剂来消化细胞。加入2毫升DMEM-FBS终止反应，并在室温下以1000转/分钟离心5分钟收集细胞。用1毫升新鲜DMEM-FBS重悬细胞，每孔分析10,000个细胞的GFP表达情况。

通过流式细胞术，使用前向散射和侧向散射参数对单个活细胞进行圈选。GFP阳性细胞通过GFP荧光检测器进行分析，结果以直方图形式呈现。剩余细胞可重新接种用于荧光显微摄影。

通过同源重组修复双链DNA断裂的通路由目标BRCA1基因调控。经同源重组修复的细胞可通过荧光显微镜轻松检测。通过RNAi耗竭BRCA1会导致检测到的GFP阳性细胞数量显著减少。

FCA 的输出结果是一个直方图，横轴表示每个细胞的 GFP 荧光强度，纵轴表示细胞数量。在未转染 I-SCE1 表达质粒的情况下，未检测到 GFP 阳性细胞。

第二至第六列的结果均来自第3天转染了表达ISC一个质粒的细胞。在单次实验的典型结果中，表达ISC一个并同时对无关基因进行对照RNA干扰时，有15.5%的细胞呈GFP阳性；相比之下，在BRCA一个基因被干扰并回补空质粒载体的情况下，GFP阳性细胞比例降低至0.7%。外源性野生型BRCA一个的加入完全恢复了同源重组活性，表现为GFP阳性细胞比例恢复至15%–16%。

类似地，另一种意义未明的变异表达。BRCA1 I21B突变完全恢复了BRCA1依赖的同源重组功能，而回补BRCA1 M18T突变则与空载对照具有相似的效果。

由于该突变体的表达水平与内源性蛋白相似，这表明BRCA1 M18T突变体在同源重组中无功能。在进行该实验操作时，需注意监测细胞生长状况，细胞生长缓慢且密度较低，因此必须减少转染混合物的使用量。同时，及时去除转染培养基也至关重要。

我们发现转染后的几天内，如果培养基中含有抗生素，细胞毒性会很高。因此，自第一天起，后续所有培养基均不含抗生素。该技术为乳腺癌研究领域的研究人员探索在临床中意义未明的BRC1变异体的遗传学特征铺平了道路。

我们希望，本研究中开发的功能性BRC1检测方法将有助于更准确地预测BRC1变异对癌症易感性的影响。