Name: 使用内源性野生型BRCA1基因的细胞表达，确定同源重组的BRCA1基因突变的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解利用体外同源重组实验检测BRCA1基因突变功能的方法，通过siRNA敲低内源蛋白并表达突变体，结合流式细胞术分析GFP阳性细胞，评估DNA修复效率。该技术为乳腺癌研究提供了可靠的基因功能分析平台。

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我们感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心为本研究提供的资助。

1. 含整合型重组底物的细胞系
<ol>
<li>HeLa 细胞通过 pDR-GFP 质粒（由纪念斯隆-凯特琳癌症中心 M. Jasin 惠赠，质粒7）进行稳定转染，并在嘌呤霉素中培养以筛选转化子。</li>
<li>细胞在含有 10% 胎牛血清、2 mM GlutaMAX、1 mM 丙酮酸钠、青霉素/链霉素（100 U/mL/0.1 mg/mL）和 1.5 µg/mL 嘌呤霉素的 DMEM/FBS 培养基中传代培养。</li>
</ol>
pDR-GFP 质粒及稳定转化子中的重组底物包含两个失活的 GFP 等位基因（图1）。其中一个等位基因因其编码序列中插入了18 bp的I-SceI限制性内切酶识别位点而失活。在这些细胞中表达I-SceI可导致双链DNA断裂（DSB）。该DNA上还存在第二个失活的GFP等位基因，但其序列中与第一个等位基因的I-SceI位点相对应的区域为野生型。该第二个GFP等位基因可作为同源重组修复DSB的序列供体，从而产生有活性的GFP等位基因，可通过流式细胞术轻松检测。 alternatively，DSB也可通过非同源末端连接方式进行修复，这将破坏I-SceI限制性酶切位点，并导致产生GFP阴性细胞。细胞中同源重组的水平通过统计GFP阳性细胞所占的百分比来确定。
在所有克隆中，该细胞系 pHeLa-DR13-9 因具有零背景的 GFP 信号，并且在转染表达 I-SceI 的质粒 pCBASce 后，GFP 阳性细胞比例相对较高而被选中。（表达 I-SceI 的质粒 pCBASce 及其空载体对照 pCAGGS 均由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的 M. Jasin 提供。） 
HeLa-DR13-9 细胞系可应要求向作者索取。

2. 转染以耗竭内源性 BRCA1 并回补突变型 BRCA1。
<ol>
<li>首次转染前一天（通常为星期二）：取一个10 cm培养皿，其中HeLa-DR13-9细胞融合度至少达到90%。</li>
<li>加入1 mL胰蛋白酶消化，再加入9 mL DMEM/FBS终止反应，用移液器轻轻吹打混匀。</li>
<li>将胰蛋白酶消化后的细胞每孔40 μL接种至24孔板中，每孔加入0.5 mL DME/FBS。</li>
<li>第1天转染（星期三）：细胞融合度应约为40–50%，若明显低于此范围则需重新开始。转染操作如下：将5 pmol siRNA与0.3 μg表达BRCA1突变体的质粒DNA溶于12.5 μL Opti-MEM中；另将0.5 μL Lipofectamine 2000溶于12.5 μL Opti-MEM中。按照Lipofectamine试剂说明书（Invitrogen）进行后续转染步骤。</li>
<li>转染后4–6小时更换培养基。我们用于敲低BRCA1的siRNA序列基于GCUCCUCUCACUCUUCAGU，靶向BRCA1 3'-UTR区域第80,780至80,798位核苷酸（GenBank登录号AY273801）。</li>
<li>第2天：用胰蛋白酶将细胞从24孔板消化后转移至6孔板。</li>
<li>第3天转染：将25 pmol siRNA、0.75 μg表达BRCA1突变体的质粒DNA以及0.75 μg pCBASce（或pCAGGS空载对照）溶于62.5 μL Opti-MEM中；另将2.5 μL Lipofectamine 2000溶于62.5 μL Opti-MEM中。转染后4–6小时更换培养基。</li>
</ol>
3. 转染细胞的分析。
<ol>
<li>第6天，用胰蛋白酶消化各孔中的细胞，并用1 mL DMEM/FBS终止消化。分析细胞的GFP表达可在第5天或第7天进行，但我们发现第6天效果最佳。</li>
<li>通过流式细胞术分析每孔10,000个细胞。我们使用俄亥俄州立大学综合癌症中心分析细胞学共享资源平台的Becton Dickinson FACSCalibur仪器。利用前向散射和侧向散射参数圈选单个活细胞。使用GFP荧光检测器（FL1）检测GFP阳性细胞，结果以直方图形式呈现（图2，底部）。</li>
<li>如有需要，剩余细胞可重新接种用于荧光显微镜拍照。</li>
</ol>
4. 代表性结果：

BRCA1 调控通过同源重组修复双链 DNA 断裂的通路6,11。通过荧光显微镜可轻松检测到经同源重组修复的细胞（图2，上方）。BRCA1 缺失会导致检测到的 GFP 阳性细胞数量减少（图2，右侧）。FACSCalibur 的输出结果为直方图，其中 X 轴表示每个细胞的 GFP 荧光强度，Y 轴表示细胞数量（图2，下方）。在单次实验的典型结果中，I-SceI 表达并进行对照 RNAi 沉默后，有 15.5% 的细胞呈 GFP 阳性（图3）。相比之下，BRCA1 沉默并回补空载体时，GFP 转化率降至 0.7%。回补野生型 BRCA1 或 BRCA1(I21V) 均可完全恢复同源重组活性，表现为 GFP 阳性细胞比例恢复至 15–16%。而回补 BRCA1(M18T) 突变体（图3，第5泳道）的效果与回补空载体对照相似。由于该变异体的表达水平与内源性蛋白相当9，因此我们认为 BRCA1(M18T) 变异体在同源重组中无功能。
转染 I-SceI 表达质粒后，通常有 10-20% 的细胞转化为 GFP 阳性细胞。BRCA1 耗竭可重复地使 GFP 阳性细胞的转化率降低约 8-10 倍。尽管不同实验中 GFP 阳性细胞的实际百分比可能有所变化，但在同一实验中，BRCA1 耗竭后相对于对照组耗竭的 GFP 阳性细胞比例相当一致。我们通过将未抑制的转化率设为 100% 来对结果进行归一化处理，并以百分比形式表示 BRCA1 耗竭及回补条件下的实验结果。通过这种方式，可以合并多个实验的数据，且实验间的变异程度较低。
迄今为止，BRCA1突变体的回补实验已获得可靠结果：每个BRCA1变异体要么完全恢复同源重组活性，要么完全无影响。获得这些结果的一个重要考虑因素是，我们的转染条件所产生的BRCA1蛋白水平大约等于未处理细胞中内源性蛋白的浓度。即使是有缺陷的BRCA1突变体，过表达水平过高也可能导致一定程度的阳性同源重组活性。
我们需要克服的一个问题是转染的毒性。BRCA1 本身的耗竭会减缓细胞生长，因此必须保持培养皿中细胞数量与 Lipofectamine-2000 及质粒 DNA 用量之间的平衡。Lipofectamine 或质粒 DNA 过量会减少细胞数量，导致细胞数量不足以获得可靠的流式细胞术结果。质粒和 Lipofectamine 试剂与转染细胞数量之间的平衡对于维持细胞活力至关重要。

 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="同源重组示意图；I-SceI 酶；GFP 修复；双链断裂过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 重组底物。图示为 M. Jasin 研究团队所开发的策略7,12。pDR-GFP 质粒包含两个有缺陷的 GFP 等位基因，其中一个含有 I-SceI 限制性内切酶识别位点。一种 HeLa 衍生的细胞系将该 DNA 底物整合于基因组中的单一位置9，通过同源重组修复 I-SceI 位点处的双链 DNA 断裂，可使其中一个等位基因转变为 GFP 阳性。
 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="RNAi效应分析；荧光显微镜图像、流式细胞术直方图、基因沉默影响。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 通过荧光显微镜检测GFP阳性细胞。按照本实验方案进行检测，对照组基因沉默的细胞在同源重组中具有活性，表现为高比例的细胞表达GFP（左图）。通过RNAi沉默BRCA1基因后，GFP阳性细胞数量显著减少（右图）。
 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="GFP阳性细胞百分比柱状图；BRCA1质粒变异，RNAi影响；遗传学实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. BRCA1错义突变体回补实验的结果。本直方图显示单次实验的结果。在未转染表达I-SceI的质粒的情况下（第1泳道），未检测到GFP阳性细胞。第2至第6泳道的结果均来自在第3天转染了表达I-SceI质粒的细胞。在无关基因（荧光素酶）被敲低并回补空载体的细胞中，15.5%的细胞为GFP阳性（第2泳道）。BRCA1被敲低并回补空载体时，显示出BRCA1缺失对同源重组的影响（第3泳道）。图中还展示了BRCA1被敲低后回补野生型BRCA1（第4泳道）、BRCA1(M18T)（第5泳道）和BRCA1(I21V)（第6泳道）的效果。这些结果来自单次实验，需与至少另外两次重复实验的数据合并，以评估特定BRCA1突变体蛋白所支持的同源重组水平。

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
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<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
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<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该方法的优势在于，我们可以利用内源性表达野生型BRCA1的细胞，研究BRCA1蛋白在同源重组介导的DNA修复中的功能。我们结合了两种已建立的实验方法：一种用于研究同源重组过程，另一种利用RNA干扰介导的基因敲降，由此建立了一种检测BRCA1变异体在DNA修复中功能的新方法。该方法成功的关键是构建一种易于转染的细胞系（例如HeLa细胞），并在其基因组中整合同源重组报告底物，从而实现高水平的GFP信号转换。我们对原始转化产生的多个克隆进行了筛选，最终获得了一个在未转染时无明显背景GFP信号、而在转染I-SceI表达质粒后能产生极高GFP转换效率的克隆。
利用该方法，我们目前正在研究其他特定的BRCA1氨基酸残基在同源重组中的功能。除了本研究所提供的生物学见解外，这些结论还可应用于临床肿瘤遗传学。大量BRCA1错义突变的临床意义尚不明确，因为存在许多罕见变异，且其中多数缺乏足够的信息，无法通过遗传分离分析确定其与癌症的关联性3,10,13,14。利用该方法，可评估特定变异对BRCA1调控同源重组生物学功能的影响，从而为携带这些基因组变异的女性提供临床参考依据。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

利用表达内源性野生型 brca1 的细胞鉴定 brca1 突变对同源重组的影响

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

错义突变的功能分析可能因细胞内存在内源性蛋白而变得复杂。BRCA1的结构-功能分析一直受到缺乏针对全长BRCA1蛋白的可靠检测方法以及使用表达功能低下型BRCA1蛋白的细胞系所固有困难的限制1,2,3,4,5。我们建立了一个系统，通过RNAi靶向BRCA1 mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR），在细胞中急性耗竭内源性BRCA1蛋白，并通过共转染表达BRCA1变异体的质粒进行替代。该方法的一个优势在于，BRCA1的急性沉默与同时替代可使细胞在无需因长期缺失BRCA1功能而产生二次突变或适应性改变的情况下正常生长。该耗竭-回补实验在一种易于检测同源重组活性的HeLa来源细胞系中完成。同源重组检测基于先前发表的方法，即将一个重组底物整合入基因组（图1）6,7,8,9。该重组底物在一个无活性的GFP等位基因内部含有罕见切割的I-SceI限制性内切酶识别位点，其下游还有一个无活性的GFP等位基因。转染表达I-SceI的质粒后，会引发双链断裂，该断裂可通过同源重组方式进行修复；若同源重组成功修复断裂，则会形成一个有活性的GFP等位基因，可通过流式细胞术检测GFP蛋白的表达水平进行定量分析。耗竭内源性BRCA1导致同源重组活性下降8至10倍，而回补野生型质粒则完全恢复了同源重组功能。当从共转染的质粒中表达特定的全长BRCA1点突变体时，即可评估特定错义突变体的功能效应。例如，表达BRCA1(M18T)蛋白（一种临床意义未明的变异体）10时，其无法恢复BRCA1依赖的同源重组功能；相比之下，另一种同样临床意义未明的变异体BRCA1(I21V)的表达则完全恢复了BRCA1依赖的同源重组功能。这种检测BRCA1错义突变功能的策略已被应用于另一个检测中心体功能的生物系统中（Kais等，未发表观察结果）。总体而言，该方法适用于对任何需以隐性方式分析的基因的错义突变体进行功能分析。

我们提供一种方法，通过RNA干扰技术耗尽细胞内源性的BRCA1蛋白，并用含有编码改变的BRCA1点突变体进行替代，在基于组织培养的体系中检测BRCA1变异体在DNA损伤同源重组修复中的功能。

利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

错义突变的功能分析可能因细胞中内源性蛋白的存在而变得复杂。……的结构-功能分析

以下实验的总体目标是利用体外同源重组实验检测BRCA1蛋白的特定变异体。该目标通过以下方式实现：首先，将针对BRCA1的短干扰RNA（siRNA）以及用于重新表达待测BRCA1变异体蛋白的质粒共转染入细胞，从而用待测变异体替代内源性的野生型BRCA1蛋白；第二步，除上述siRNA和表达突变型BRCA1的质粒外，还共转染一个表达ISCE1蛋白的质粒，后者可在测试细胞基因组DNA的特定位点诱导DNA损伤。随后，细胞被孵育两至三天，以允许DNA损伤与修复过程发生。最终通过流式细胞术分析表达GFP的细胞，获得结果，用以判断BRCA1蛋白的特定变异体是否具有通过同源重组途径参与DNA修复的功能。该技术结合了两种已建立的方法，从而构建出一个多功能系统，用于分析同源重组修复DNA损伤过程中特定蛋白质变体的功能。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，以往的方法依赖于BRCA1基因敲除的细胞系，而我们采用了一种更易操作的细胞系，该细胞系源自HELOC细胞，可通过RNA干扰技术敲低内源性BRCA1蛋白，并在这些细胞中回补待测蛋白。现在表达一种BRC1蛋白的变异体后，我们可以检测同源重组。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到操作过程中细胞死亡过多的问题。因此，必须仔细设置转染条件，在最大化重组反应效果的同时，尽量减少细胞毒性。在本方案开始之前，已通过将 P-D-R-G-F-P 质粒转染至 HeLa 细胞中建立了 HeLa DR13-9 细胞系。使用含嘌呤霉素的 10 厘米培养皿维持该细胞系，以筛选稳定转染的细胞。P-D-R-G-F-P 质粒及稳定转染子中的重组底物包含两个失活的 GFP 等位基因。其中一个等位基因因插入了 18 个碱基对的限制性内切酶 ISCE1 识别位点而失活。在其编码序列中，ISCE1在这些细胞中的表达会在非活性GFP的第二等位基因上产生一个双链DNA断裂（DSB）。该序列中与第一等位基因上的ISCE1位点相对应的区域为野生型。这个第二GFP等位基因可作为同源重组修复DSB的序列供体，从而产生一个有活性的GFP等位基因，可通过流式细胞术在首次转染前一天轻松检测到。取一个10厘米培养皿，内含至少90%融合的HeLa DR139细胞，加入1毫升胰蛋白酶消化液，作用2至3分钟。加入9毫升含胎牛血清的D-MEM培养基终止反应，并通过移液充分混匀细胞悬液。将40微升胰蛋白酶消化后的细胞加入24孔板的每个孔中，每孔含0.5毫升D-MEM-FBS培养基，于37°C及5%二氧化碳条件下过夜培养。第一天，细胞融合度应介于40%至50%之间。开始转染时，将用于敲低内源性B RCA1的irna与表达B RCA1突变体的质粒一同加入最适培养基中进行混合。随后，将核酸与lip在最适培养基中混合。转染后按照制造商的说明进行脂质体转染操作。将细胞放回培养箱继续孵育。4至6小时后，更换为不含抗生素的培养基。第二天将细胞放回培养箱中过夜培养。在37摄氏度短暂孵育后，向每个孔中加入0.3毫升三联胰蛋白酶试剂，通过反复吹打使细胞在胰蛋白酶试剂中解离。一旦完成消化，立即将细胞从24孔板转移至含有2毫升D-M-E-M-F-B-S的6孔板中，以终止胰蛋白酶活性。将六孔板在与初次转染后两天相同的条件下孵育过夜。在62.5微升Opti-MEM中配制SIR A、BRCA1突变型表达质粒DNA以及ISCE1表达质粒。将该溶液与2.5微升Lipofectamine 2000和2.5微升Opti-MEM混合。在孵育四到六小时后，进行细胞转染。将培养基更换为不含抗生素的D-M-E-M-F-P-S培养基。在第六天将细胞放回培养箱中继续孵育。通过向每个孔中加入0.5毫升胰蛋白酶试剂来消化细胞。加入2毫升DMEM-FBS终止反应，并在室温下以1000转/分钟离心5分钟收集细胞。用1毫升新鲜DMEM-FBS重悬细胞，每孔分析10,000个细胞的GFP表达情况。通过流式细胞术，使用前向散射和侧向散射参数对单个活细胞进行设门。GFP阳性细胞通过GFP荧光检测器进行分选，结果以直方图形式呈现。剩余细胞可重新接种用于荧光显微成像。通过同源重组修复双链DNA断裂的通路受到目标BRCA1的调控。经同源重组完成修复的细胞可通过荧光显微镜 readily 被检测到。通过RNAi耗竭BRCA1会导致检测到的GFP阳性细胞数量显著减少。FCA 的输出结果是一个直方图，横轴表示每个细胞的 GFP 荧光强度，纵轴表示细胞数量。在未转染 I-SCE1 表达质粒的情况下，未检测到 GFP 阳性细胞。第二至第六列的结果均来自第3天转染了表达ISC一个质粒的细胞。在单次实验的典型结果中，表达I SCE一个并同时对无关基因进行对照RNAi敲低后，有15.5%的细胞呈GFP阳性；相比之下，敲低BRCA一个并回补空质粒载体后，GFP转化率降低至0.7%；而外源添加野生型BRCA一个可完全恢复同源重组活性，表现为GFP阳性细胞比例恢复至15%–16%。类似地，另一种意义未明的变异表达。BRCA1 I21B突变完全恢复了BRCA1依赖的同源重组功能，而回补BRCA1 M18T突变体的效果与空载体对照相似。由于该突变体的表达水平与内源性蛋白相似，这表明BRCA1 M18T突变体在同源重组中无功能。在进行该实验操作时，需注意监测细胞生长状况，细胞生长缓慢且密度较低，因此必须减少转染混合物的使用量。同时，及时去除转染培养基也至关重要。我们发现转染后的几天内，如果培养基中含有抗生素，细胞毒性会很高。因此，自第一天以后的所有培养基中均不含有抗生素。该技术为乳腺癌研究领域的研究人员探索在临床癌症诊疗中具有未知临床意义的BRC1变异体的遗传学特征铺平了道路。我们希望，本研究开发的功能性BRC1检测方法将有助于更准确地预测BRC1变异对癌症易感性的影响。

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Biology

生物学

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通过siRNA实现基因沉默是一种便捷的实验策略，可用于分析BRCA2依赖的生物学功能，有助于更好地理解癌症生物学。本文介绍了一种高效沉默BRCA2基因的方法，以及在人源细胞系中通过免疫印迹检测和定量BRCA2蛋白表达变化的实验流程。...

在培养的人类细胞中沉默BRCA2以鉴定新型BRCA2调控的生物学功能

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

携带BRCA1基因突变的个体患癌风险更高，因此有必要对BRCA1变异体的功能进行准确评估。本文介绍了一种利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器在活细胞中实现靶向C:G到T:A转换的功能评估BRCA1变异体的实验方案。...

利用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA...

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。...

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

本方案旨在研究DNA复制过程中发生的DNA损伤程度。在中性条件下，可在较短时间内快速评估DNA断裂的诱导情况。此外，该方案可适用于其他细胞类型及多种复制应激试剂。...

通过中性彗星实验检测分裂中人类细胞的DNA断裂

了解利用体外同源重组实验检测BRCA1基因突变功能的方法，通过siRNA敲低内源蛋白并表达突变体，结合流式细胞术分析GFP阳性细胞，评估DNA修复效率。该技术为乳腺癌研究提供了可靠的基因功能分析平台。

利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

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