可视化病毒侵染细胞中的转录抑制现象

从载有经尿苷类似物预处理的哺乳动物细胞的盖玻片开始，其中一组细胞经病毒感染，另一组未感染。

在病毒感染的细胞中，病毒蛋白会结合宿主的转录机制并抑制宿主RNA的产生，而在未感染的细胞中，RNA合成则持续进行。

用缓冲液洗涤。加入多聚甲醛固定细胞，然后洗涤。加入去垢剂以通透细胞膜，然后再次洗涤。

将盖玻片转移至湿盒中。

加入含有荧光叠氮化物、催化剂和还原剂的点击染色溶液，避光孵育。

还原剂激活催化剂，从而促使荧光叠氮化物与尿苷标记的新生RNA结合。

用缓冲液冲洗盖玻片，将其浸入水中，然后除去多余的水分。

使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固在载玻片上，并自然晾干。

在倒置荧光显微镜下，与未感染细胞相比，感染细胞中信号强度的降低表明病毒诱导的转录抑制。

将直径12毫米的圆形盖玻片放入12孔细胞培养板的每个孔中。然后在1毫升完全DMEM培养基中接种293细胞。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中过夜培养。根据实验设计，稀释病毒原液，使每孔以200微升的总体积接种MP-12病毒时感染复数为3。指定一个孔作为未感染对照，另一个孔作为转录抑制对照。现在移除生长培养基。加入病毒接种物，并在湿润培养箱中孵育1小时。吸除接种物。每孔加入1毫升新鲜生长培养基，并在37摄氏度继续孵育。感染后15小时，将生长培养基更换为含有1毫摩尔尿苷类似物5-乙炔基尿苷的培养基。在其中一个模拟感染孔中，同时加入5微克/毫升的DNA依赖性RNA合成抑制剂放线菌素D。将细胞放回培养箱继续培养。感染后16小时，移除培养基，并用每孔1毫升PBS洗涤盖玻片一次。每孔用1毫升4%多聚甲醛固定细胞。再用每孔1毫升PBS冲洗一次。

为组装湿化室，使用直径为10厘米的细胞培养皿或培养皿，并在其底部铺上一层塑料封口膜。将湿润的纸巾沿培养皿边缘内侧贴附。接下来，为透化细胞，加入1毫升含0.2% Triton X-100的PBS溶液。室温孵育10分钟。经过三次PBS洗涤后，将盖玻片转移至湿化室中。为进行点击反应以检测标记的RNA，每张盖玻片上覆盖50至100微升新鲜配制的点击染色溶液。室温避光孵育1小时。

向新的12孔板各孔中加入1毫升PBS，将盖玻片转移至孔中。每孔用1毫升PBS再洗涤两次。为进行荧光显微镜观察，取一滴Fluoromount-G置于载玻片上。将盖玻片浸入水中，去除多余水分后，将细胞面朝下放入Fluoromount-G液滴中，室温晾干5分钟。