利用流式细胞术分析病毒诱导的宿主转录抑制

取哺乳动物细胞培养物。用病毒感染实验组培养物，对照组则不感染病毒。

让病毒吸附后，更换培养基。

病毒进入细胞并释放其基因组。病毒表达一种毒力蛋白，该蛋白可破坏宿主转录因子复合物，从而抑制宿主的转录活动。

然而，对照细胞保持活跃的转录。

加入一种可掺入新生RNA的核苷类似物。

收集洗涤后的细胞。

固定细胞以保持其结构。离心细胞并用缓冲液洗涤。

加入去垢剂以透化细胞，然后洗涤。

加入一种可与核苷类似物反应的化学修饰荧光染料，以标记新生RNA；随后洗涤。

进行免疫染色以荧光标记病毒抗原，标记感染的细胞。

使用流式细胞术检测宿主 RNA 和病毒抗原的荧光。

比较对照组与实验组群体的RNA荧光强度。实验组群体出现荧光强度降低的下移现象，提示存在病毒诱导的转录抑制。

根据实验设计，用MP-12以3的感染复数（MOI）感染293细胞。吸除培养基后，加入稀释的病毒液，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育1小时。随后每孔更换为2毫升新鲜培养基，在37摄氏度继续孵育至病毒标记和收获的最佳时间。然后将其中一孔模拟感染细胞的培养基更换为含有0.5毫摩尔5-乙炔基尿苷的培养基，并同时加入5微克/毫升放线菌素D。将细胞放回培养箱孵育1小时。经一次PBS洗涤后，通过胰蛋白酶消化收集细胞。用含1毫摩尔EDTA的PBS洗涤收集的细胞三次。为固定细胞，将细胞沉淀重悬于1毫升4%多聚甲醛中，室温孵育30分钟。每管用1毫升PBS-EDTA洗涤一次。随后在室温下用含0.2% Triton X-100的PBS溶液0.5毫升对细胞进行透化处理，持续10分钟。再用1毫升无核酸酶PBS洗涤一次。进行点击反应时，将细胞沉淀重悬于200微升含荧光染料的点击染色液中。若细胞发生聚集，可通过移液重新悬浮。室温避光孵育1小时。最后用FACS缓冲液洗涤两次。