利用T7表达系统生成GFP标记的重组呼吸道合胞病毒

从含有编码呼吸道合胞病毒（RSV）复制和转录蛋白的辅助质粒以及携带全长、表达绿色荧光蛋白（GFP）的RSV抗原组cDNA的单独质粒的混合物开始。

每种质粒均置于T7启动子的控制之下。

加入基于脂质体的转染试剂，并孵育以促进复合物形成。

将这些复合物导入表达T7 RNA聚合酶的基因工程仓鼠肾细胞中，并进行培养。

质粒复合物进入细胞后，T7 RNA 聚合酶转录 RSV 质粒。

这可产生编码复制和转录蛋白的病毒mRNA，并生成正链RSV抗基因组RNA。

利用宿主细胞的机制，这些mRNA可产生病毒复制和转录所需的蛋白质，进而形成具有功能的RSV聚合酶复合物。

RSV聚合酶复合物随后将正链RNA转化为病毒基因组RNA。

该基因组RNA指导病毒mRNA的合成，这些mRNA编码结构蛋白和GFP。

在荧光显微镜下，绿色荧光表明病毒基因表达以及重组呼吸道合胞病毒（RSV）的产生已启动。

转染前一天，将 BSR-T7/5 细胞悬浮于完全培养基中，浓度为每毫升 0.5 × 10⁶ 个细胞。每孔加入两毫升细胞悬液至六孔板中。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，直至次日细胞融合度达到 80–90%。为拯救每种病毒，首先在离心管中混合解冻的反向遗传学载体，然后按照转染试剂生产商的说明书进行转染。接着，向混合后的载体中加入 250 µL 低血清培养基。

在另一支试管中，将10 µL转染试剂加入250 µL低血清培养基中稀释。轻轻涡旋混匀两支试管，室温静置5分钟。将两支试管中的溶液混合，室温下静置20分钟。

同时，用1 mL低血清培养基冲洗BSR-T7/5细胞，并向每孔加入1.5 mL含10%胎牛血清的无抗生素最低必需培养基。必要时，在37 °C、5% CO2环境中孵育。20分钟孵育结束后，向每孔加入500 µL转染混合物。将细胞在37 °C、5% CO2环境中孵育3天。为监测病毒拯救效率，每天在倒置荧光显微镜下使用20倍物镜观察一次绿色荧光蛋白（GFP）荧光。