感染性呼吸道合胞病毒的蚀斑滴定法

取呼吸道合胞病毒（RSV）悬液的系列稀释液。

将每种稀释度分别接种至已接种易感呼吸道合胞病毒的哺乳动物细胞的多孔板的不同孔中。

孵育以使病毒结合细胞表面受体，介导膜融合，并将其基因组释放到细胞质中。

接下来，加入半固体覆盖培养基以限制病毒扩散，并进行孵育。

被感染的细胞表达介导细胞间融合的病毒融合蛋白，形成称为合胞体的多核结构。

随着病毒复制的进行，这些合胞体会发生退化，形成称为蚀斑的透明区域。

轻轻摇晃培养板以去除覆盖层，并冲洗细胞以清除碎片。

加入染料对活细胞进行染色，使空斑保持无色。

去除染料，用漂白剂对培养皿进行去污处理，然后用水冲洗。

让培养板自然风干。

选择具有明显斑块的孔，计数斑块以确定病毒滴度。

进行蚀斑滴定实验时，首先通过将商品化的10倍浓缩最低必需培养基（MEM）用无菌水稀释，并添加L-谷氨酰胺、每毫升1000单位的青霉素和每毫升1毫克的链霉素，配制2倍浓缩的最低必需培养基（2X MEM）。充分振荡混匀后，于4摄氏度保存。然后，将不含胎牛血清（FCS）的MEM培养基各900微升加入六个试管中。将病毒分装样品解冻，并剧烈涡旋震荡5秒钟。

进行连续稀释时，首先在第一支试管中加入100微升病毒液和900微升培养基。盖上管盖，并通过涡旋振荡数秒以混匀内容物。然后取100微升第一管中的稀释液加入含有900微升培养基的第二支试管中。盖上管盖并涡旋振荡。重复此操作直至第六支试管。在HEp-2 12孔板上标注病毒名称及完整的稀释倍数。对培养板及其盖子做匹配标记，因为在染色过程中它们可能会被分开。

移除培养板中的培养基，每孔加入 400 微升一种稀释度的病毒悬液。将培养板在 37 摄氏度孵育 2 小时，以进行病毒吸附。在病毒吸附期间，通过使用 7.5% 无菌碳酸氢钠溶液根据颜色指示剂将 2X MEM 的 pH 值调节至约 7.2，从而配制微晶纤维素覆盖层。

为获得 100 毫升覆盖液，加入 10 毫升 2X MEM、10 毫升 2.4% 单晶纤维素悬浮液以及 80 毫升添加了 2% FCS 的 MEM，并充分混匀。在两小时孵育结束后，向 12 孔板的每孔中加入 2 至 3 毫升覆盖液，无需移除接种物。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育六天。

使用结晶紫溶液染色细胞时，首先轻轻摇晃培养板以去除微晶纤维素覆盖层。移除上清液后，用1× PBS洗涤细胞两次，然后加入1至2毫升结晶紫溶液，静置10至15分钟。移除染色液（可回收用于后续培养板的染色）。最后，根据干燥培养板中可见空斑数量与接种体积及稀释倍数的比值，计算病毒滴度。