使用放射性标记的逆转录酶检测法评估病毒复制能力

采集含有子代病毒颗粒的培养上清液，这些病毒颗粒来自感染了测试用HIV-1变异株或野生型对照株的宿主细胞。

该检测病毒携带一种基因变异，可改变其复制效率并影响子代病毒颗粒的产生。

将上清液加入含有放射性标记核苷酸、非标记核苷酸、RNA模板、引物、辅助因子、去垢剂和稳定剂的逆转录反应体系中。

孵育以促进模板-引物复合物的形成，同时裂解病毒颗粒的去污剂可释放逆转录酶（RT）。

逆转录酶（RT）以模板-引物复合物为模板合成DNA，并掺入放射性标记的核苷酸。

将样品转移至核酸结合膜上，并在空气中干燥以固定放射性标记的DNA。

在振荡条件下，用缓冲液和乙醇反复洗涤，以去除未结合的组分。

将膜自然晾干并用保鲜膜包裹。将其暴露于磷屏成像仪的感光屏上，使用磷屏成像仪检测信号。

检测中信号减弱表明逆转录酶（RT）水平较低，反映出与对照相比病毒颗粒的产生减少。

在此步骤中，向每份1毫升的RT预混液中加入1至2微升浓度为10毫居里/毫升的dTTP以及4微升1摩尔的二硫苏糖醇。使用1000微升移液器小心混匀每支1.5毫升微量离心管中的RT预混液、DTT和dTTP，然后转移至无菌槽中。

接下来，将25 µL标记的RT反应液加入至96孔薄壁PCR板的每个孔中。向含有RT预混液的PCR板中加入5 µL每种上清液。然后用粘性铝箔封膜密封PCR板，并在37 °C下于热循环仪中孵育2小时。孵育后，使用200 µL多通道移液器在铝箔封膜上刺出小孔。将样品混合5次。将每份样品5 µL转移至DE-81滤纸，并将所有样品在空气中干燥10分钟。将滤膜分别放入不同的洗涤容器中。随后用1×SSC缓冲液洗涤滤膜5次，每次5分钟；再用90%乙醇洗涤2次，每次5分钟，之后让其自然晾干。干燥后，小心地用保鲜膜包裹滤膜，并在室温下将其置于密闭暗盒中与磷屏接触曝光过夜。

准备就绪后，使用磷屏成像仪分析磷屏并定量放射性转录产物。