生成慢病毒转导的小鼠胚胎干细胞

从携带抗生素抗性基因的慢病毒开始。

离心以分离碎片。收集含有病毒的上清液，并使其通过无表面活性剂的膜。

这使得慢病毒能够通过，同时保留污染物。

通过超速离心浓缩病毒。去除上清液，并加入缓冲液重悬病毒。

然后将悬液转移至微量离心管中，并涡旋混匀。

离心去除气泡，然后将病毒加入含有小鼠胚胎干细胞的感染培养基中并混匀。

离心以增强病毒与细胞的接触，然后孵育。

病毒将其基因组递送至细胞内。

移除培养基，加入新鲜培养基并继续培养。

病毒基因组被转化为DNA并整合到宿主基因组中，从而能够产生mRNA，指导抗生素抗性蛋白的合成。

更换为含有筛选抗生素的新鲜培养基，并继续培养。

表达抗生素抗性蛋白的细胞得以存活，从而获得稳定的病毒感染细胞。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。

在感染前一天，将先前准备好的 mESC 以每孔 100,000 个细胞的密度传代至 12 孔板中。对于在 10 厘米培养皿中培养的细胞，吸除旧培养基，加入 5 mL 1× PBS，吸除 PBS，再加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶。于 37 °C 将细胞在胰蛋白酶中孵育 8 分钟，在孵育中途轻轻摇晃并轻敲培养皿使细胞脱落。

在换液后48小时，移除并转移293T-HEK细胞的上清液至一个50毫升的锥形管中。在300 × g条件下离心上清液5分钟，以沉淀细胞碎片。接着，通过0.45微米滤膜过滤上清液。使用SW32转子进行超速离心浓缩病毒，在4摄氏度下以72,000 × g转速离心样品两个半小时。在病毒进行超速离心浓缩的同时，用含有5微克/毫升聚凝胺的新鲜胚胎干细胞（ES）培养基处理12孔板中的CiA mESC。病毒浓缩完成后，小心吸除上清液，并将病毒沉淀物轻轻重悬于100微升1×PBS中，避免产生过多气泡。

将病毒和1X PBS加入一个1.5毫升的微量离心管中。在最低转速下涡旋振荡管子，以充分重悬病毒。在小型台式离心机中离心5至10秒，以去除气泡。

向12孔板的每个孔中加入30 µL病毒。轻轻摇晃孔板，然后在1,000 ×g 条件下离心20分钟。将12孔板放回37 °C培养箱中过夜。

次日早晨，更换为新鲜的 ES 培养基，继续感染 48 小时。感染 48 小时后，通过添加适当的抗生素筛选成功整合病毒质粒的细胞。每天更换培养基。在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中，将筛选培养基作用于细胞 72 至 96 小时。