利用代谢与荧光筛选鉴定重组痘苗病毒感染细胞

从感染了痘苗病毒并转染了重组质粒载体的上皮细胞开始。

该载体携带一个在病毒启动子驱动下的绿色荧光标记靶基因和一个红色荧光标记的代谢筛选基因。

在病毒DNA复制过程中，质粒盒被插入到病毒基因组中。

在无血清培养基中收集细胞。

采用冻融循环裂解细胞并释放病毒。

制备裂解液的系列稀释液。

用稀释的裂解液感染新鲜的上皮细胞，以获得分离的单个噬斑。

加入含血清的培养基以维持细胞存活，并加入代谢选择试剂，然后孵育。

筛选试剂可抑制参与核苷酸合成的酶。只有携带代谢筛选基因的感染细胞才能表达一种替代酶，从而进行核苷酸合成，实现存活。

吸去培养基，置于荧光显微镜下观察。

斑块中同时出现红色和绿色荧光表明目标基因的表达盒已成功整合并表达。

在无血清培养基中，用痘苗病毒感染一层 BS-C-1 细胞。

感染后1小时，用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）恢复细胞。在无血清培养基中，以3:1的比例转染重组载体质粒与转染试剂的混合物。24小时后，在不含胎牛血清（FBS）的DMEM中刮取并回收细胞。对细胞进行三次冻融循环，以裂解细胞并释放病毒颗粒。接下来，为获得足够分离的单个噬斑，用病毒颗粒制备物的系列稀释液感染100%汇合的BS-C-1细胞单层。加入含10% FBS的液态DMEM覆盖，并添加GPT筛选试剂，于37℃孵育24小时。

吸去液体覆盖层，使用荧光显微镜观察噬斑，寻找因TDS载体中的mCherry整合入病毒而产生的弥散性红色荧光。根据目标基因和所选荧光标签的不同，标签基因的定位荧光也可能在同一红色噬斑中被观察到。