癌症细胞中腺病毒转导与siRNA介导的基因沉默联合应用

取一培养皿表达内源性靶蛋白的人类癌细胞，并移除培养基。

取含有编码荧光标记靶蛋白基因的重组腺病毒悬液。

加入少量病毒悬液至细胞中，以确保病毒与细胞表面紧密接触。

偶尔振荡孵育，以促进病毒附着。

向培养物中添加额外的培养基。

接下来，引入靶向内源性目标蛋白mRNA的siRNA–磷酸钙复合物，并进行孵育。

磷酸钙可增强siRNA的摄取，随后siRNA被加载到RISC复合物中。

siRNA–RISC 复合物随后结合并切割靶标 mRNA，从而抑制蛋白质表达。

同时，腺病毒进入细胞并释放其DNA，从而指导表达带有荧光标记的目标蛋白。

这可以实现内源性靶蛋白的耗竭，同时被荧光标记蛋白所替代。

用缓冲液洗涤细胞，并进行荧光成像以分析目标蛋白。

为每种条件标记一个1.5毫升微量离心管，并加入400微升预热的不含血清的α-MEM培养基。将病毒分装液在冰上缓慢解冻后，按所需体积将每种病毒加入对应管中，并用移液器轻轻吹打混匀。接着，吸除细胞培养皿中的培养基，然后将病毒混合液逐滴轻柔地加入。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。在1小时的时间内，每隔15分钟，在无菌操作台内小心震荡培养板，使病毒均匀覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。

孵育后，轻轻吸取 1.6 毫升不含血清的 α-MEM 培养基加入每孔，使总体积达到 2 毫升。同时，准备 siRNA 转染混合液：在微量离心管中加入 139 微升无菌水、50 微升 1 摩尔氯化钙和 11 微升 20 微摩尔 siRNA。若无需 siRNA，则用等量无菌水替代 siRNA 以进行空载转染。将 HBSS-2X 溶液缓慢逐滴加入氯化钙与 siRNA 的混合液中。使用 200 微升移液器通过空气吹打轻轻混匀两次，较小的沉淀物有助于提高转染效率。随后将混合液在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，将 200 微升混合液缓慢逐滴加入每孔，并轻轻振荡混匀。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。