工程化病毒样颗粒表面可及半胱氨酸残基的标记

从感染的烟草叶片中纯化的突变型病毒样颗粒（VLPs）悬液开始。

突变型病毒样颗粒（VLPs）在病毒衣壳蛋白的特定位置通过基因插入了半胱氨酸残基。

加入马来酰亚胺偶联的荧光染料，并在避光条件下孵育混合物。

马来酰亚胺仅与病毒样颗粒（VLP）表面暴露的半胱氨酸残基结合，而蛋白质结构内部埋藏的半胱氨酸则无法接触，保持未标记状态。

加入还原剂以阻断任何未反应的染料，并防止非特异性标记。

将样品加入装有多孔树脂的脱盐柱中，然后离心以纯化标记的病毒样颗粒（VLPs）。

未反应的染料和还原剂会扩散到多孔树脂珠中并被截留，而较大的病毒样颗粒（VLPs）则被排除在孔外，首先被洗脱出来。

现在可以使用凝胶电泳分析荧光标记的病毒样颗粒（VLPs）。

凝胶上的荧光条带显示了表面暴露的半胱氨酸残基的标记突变体。

在利用携带玉米粗缩病毒（MRFV）野生型和半胱氨酸突变型外壳蛋白基因的马铃薯X病毒（PVX）载体质粒产生加帽T7-RNA转录本后，取两份各10微升的转录产物接种两片N. benthamiana叶片。将植株置于温室中培养10天，条件为60%湿度，16小时光照（25摄氏度），8小时黑暗（20摄氏度）。培养结束后收获病毒感染的叶片，称取植物组织重量并置于冰上。根据文本所述方案纯化病毒样颗粒（VLPs）后，用50毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.0）含1毫摩尔EDTA配制1毫摩尔浓度的荧光素-5-马来酰亚胺溶液。涡旋混匀至完全溶解，并用铝箔包裹避光。取约30微升浓度为1微克/微升的VLPs与60微升荧光素-5-马来酰亚胺溶液混合，室温孵育2小时或4摄氏度过夜。加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度50毫摩尔以终止反应。使用脱盐离心柱去除未反应的荧光素。为观察具有可用于交联的游离半胱氨酸残基的VLPs，进行SDS-PAGE分析，向每份10微升反应液中加入10微升2倍上样缓冲液。标记后的蛋白应避光保存，可在4摄氏度保存一个月，或分装为单次使用量于-20摄氏度保存三个月。