通过二硫键再桥接实现病毒样颗粒的荧光功能化

从病毒样颗粒（VLPs）开始，其衣壳表面暴露有二硫键。

加入还原剂以断裂二硫键，生成游离的巯基，同时保持衣壳结构完整。

将还原后的病毒样颗粒与巯基反应性聚乙二醇（PEG）连接子混合，以防止巯基重新氧化。

PEG连接子通过形成两个共价键来重新连接每对巯基。

这种共价偶联还会形成一种在紫外光照射下呈亮黄色荧光的结构。

长时间旋转混合物，以确保完全偶联。

使用离心过滤法纯化聚乙二醇化的病毒样颗粒，去除未反应的小分子，同时保留完整的偶联产物。

进行非还原性SDS-PAGE以检测PEG的连接，表现为荧光的衣壳蛋白条带。

使用天然琼脂糖凝胶电泳评估结构完整性，其中聚乙二醇化与非聚乙二醇化的病毒样颗粒（VLPs）出现相似条带，表明完整VLPs的存在。

本方案可获得适用于成像或靶向递送应用的荧光标记且含聚乙二醇修饰的病毒样颗粒。

该示意图展示了将要演示的偶联过程。每毫克 Q-Beta 中的二硫键使用 10 倍当量的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP），在室温下反应 1 小时，以将所有二硫键还原，生成还原态 Q-Beta 衣壳。在对 Q-Beta 的二硫键进行还原前，需现配新鲜的 TCEP 溶液。

将0.002克TCEP溶解于1毫升超纯水中，配制100倍浓缩液。向一微量离心管中加入200微升浓度为5毫克/毫升的Qβ。然后向该微量离心管中加入20微升100倍浓缩的TCEP溶液。室温孵育1小时。

同时，配制用于后续重新桥接还原型二硫键反应的二溴马来酰亚胺聚乙二醇（DB-PEG）溶液。将 0.0017 克 DB-PEG 溶解于 100 微升二甲基甲酰胺中。加入 680 微升 10 毫摩尔磷酸钠溶液（pH 5）。接着，将还原后的 Q-Beta 加入 DB-PEG 溶液中，并在手持式 365 纳米紫外灯下观察混合过程。混合后，应立即观察到明亮的黄色荧光。将反应混合物置于室温下，于旋转仪中反应过夜。

次日早晨，使用1X PBS在4 °C条件下以3,283 × g离心20分钟，通过离心滤膜纯化反应混合物。最后，通过非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和天然琼脂糖凝胶电泳监测偶联反应。