从转染细菌人工染色体衍生合成RNA的细胞中拯救感染性病毒颗粒

从贴壁的、可被病毒感染的细胞单层开始。

洗涤细胞，然后加入解离剂使其脱离。

离心并弃去上清液。洗涤细胞以去除残留的培养基。

用缓冲盐溶液重悬细胞，然后将细胞转移至电转杯中。

引入在细菌人工染色体中携带的全长日本脑炎病毒（JEV）cDNA克隆转录的RNA。

施加电脉冲以瞬时增加细胞膜通透性，使RNA进入细胞。

让细胞恢复，然后将其转移至培养基中。

所引入的RNA模拟天然病毒RNA以产生新的病毒颗粒。

将细胞进行连续稀释，并接种到新鲜的细胞单层上。

孵育以使病毒颗粒感染邻近细胞。

加入琼脂糖培养基并孵育。该培养基形成半固体层，限制病毒向邻近细胞扩散。

感染的细胞发生裂解并形成清晰的蚀斑，证实成功拯救出具有感染性的日本脑炎病毒（JEV）。

取接种于150毫米培养皿中、密度为每皿300万个细胞、培养24小时的BHK-21细胞。用预冷的A溶液冲洗细胞单层，随后通过胰蛋白酶消化法使细胞脱落。在台式离心机中以270 × g离心2分钟收集细胞。

然后将细胞重悬于50毫升冷的A溶液中，并再次离心沉淀。重复此洗涤步骤三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于A溶液中，浓度为每毫升2000万个细胞。然后在2毫米比色皿中，取400微升细胞悬液与2微克合成RNA混合。

在最佳条件下立即对混合物进行电穿孔，并让细胞静置10分钟。随后将细胞转移至含有600 µL完全培养基的微量离心管中。用1 mL体积对电穿孔后的细胞进行10倍系列稀释。取每种稀释液100 µL接种于正常的BHK-21细胞单层上。在孵育4至6小时后，用含10%胎牛血清的MEM中添加0.5%琼脂糖覆盖细胞，并继续培养4天。