使用Qiagen质粒小提试剂盒从细菌菌落中纯化质粒DNA

我来自加利福尼亚大学欧文分校生理学与生物物理学系 Mike Halen 的实验室。今天我将向您展示如何使用胶原质微柱来纯化细菌DNA。这是我在进行位点定向诱变实验中的一个步骤。

获得质粒后，我将对插入片段进行测序，以确认所选克隆含有预期的突变。在进行小量提取之前，简要回顾一下我们昨天的工作。为了培养细菌，我需要先将5 mL的A LB培养基分别接种到各个试管中。

如您所见，在将细菌接种到试管之前，培养基是澄清的。然后我使用移液器从空气平板上挑取单菌落进行接种，并且每次更换枪头，以避免污染。接着将试管放入摇床中，以300 RPM的转速振荡培养至少8小时，通常我们可以过夜培养。

胶原蛋白小量制备试剂盒中有三种重要的缓冲液，分别为P一、P二和N三。我们通常将P一置于4摄氏度保存，因为它含有RNase；P二则在室温下放置；N三在实验前八小时左右进行预处理。

如您所见，现在的培养基变得浑浊，这是因为其中有细菌生长。我将取5 µL培养基转移到另一块平板上。这样，在确认克隆后，我可以直接回溯到该细菌，而无需再次进行转化实验。离心培养基后，您可以看到试管底部形成了清晰的细菌沉淀，我们会将上清液移除至含漂白剂的容器中，以避免对环境造成污染，而沉淀物仍保留在管中。

现在我将缓冲液P1加入细菌沉淀中。P1是重悬缓冲液，用于重悬细菌。接下来，我将用移液器反复吹打溶液，使细菌与缓冲液充分混匀。

在此阶段，溶液中不应看到任何细菌菌膜。现在，我将把重悬的细菌转移到一个新的离心管中。我总是会对离心管进行标记，以便追踪并明确每种溶液来自哪个克隆。

现在向每根离心管中加入缓冲液P2，缓冲液P2是一种用于裂解细菌的裂解缓冲液。加入缓冲液P2后，可见溶液仍未变澄清。现在将所有离心管颠倒数次，使溶液充分混匀。

现在你可以看到溶液变得澄清。接下来，我向每个管中加入缓冲液 N3 和缓冲液 M3，后者为中和缓冲液。一旦加入缓冲液 N3，我立即观察到蛋白质沉淀，但仍需将各管颠倒数次，以充分混匀溶液。

充分混匀溶液后，加入缓冲液和三号试剂，应呈现此状态。接下来，我将使用 SGE 在离心机中以 10 分钟的时间离心沉淀蛋白质，我已组装好 Cal VAC six S。

我将所有部件按顺序组装好，然后将其连接到真空系统。现在我将校准准备辅助装置的带子固定到歧管上。今天我只进行一个样品，因此我会堵住其他插槽。

因此我们已获得良好的真空环境。如您所见，我已根据试管对绑带进行了标记，开启真空后，系统已达到良好的真空状态。好的，离心结束后，您可以看到蛋白质沉淀在管底，而DNA应仍溶解在上清液中。

现在进行转移，即含有DNA的上清液，将其转移至硅胶膜条上。需要说明的是，我们每次操作都必须更换吸头，以防止交叉污染。现在打开真空泵。现在关闭真空泵，并加入PB缓冲液洗涤硅胶膜条，此时DNA已结合在膜上。

现在，我将PB溶液加入到膜条上以洗涤，此时膜条上仍含有滤膜中的DNA。这次只要我不触碰到膜条，就不需要更换枪头。接下来，我以与加入PB缓冲液相同的方式将缓冲液P加入到膜条上。

开启真空泵后，我将重复此操作两次。如您所见，目前P溶液正通过层析条，我们将继续抽真空五分钟，以确保滤膜完全干燥。抽真空五分钟后，将层析条从盒子中取出，用Kimwipe纸包裹，然后敲击桌面以去除残留的P缓冲液。

现在你可以看到，P缓冲液的液滴很少，DNA仍应留在滤膜中。这是收集用的微量离心管，我已根据条带进行了标记。

现在我打开汽车真空泵，将收集用的微量离心管重新组装好，并确保卡槽与微量离心管对齐。此时，多通道装置应呈现如上所示的外观。这是真空多通道装置的外观图，已准备就绪，用于将DNA从吸附柱洗脱至微量离心管中。

条带位于上方，管子紧接其下，两者标记方式相同。现在将无菌水加入条带中，不抽真空，静置一分钟。此次抽真空时间较长，如您所见，水正通过条带并进入收集用微量管中。

水中含有DNA。我还会继续开启真空泵一段时间，以确保收集到所有的水。以下是经过此步骤后含有DNA溶液的收集微量离心管。

您好，我刚刚向您展示了如何使用钙质小量提取试剂盒从细菌中纯化核酸。接下来，我将对插入片段进行测序，以验证正确的克隆，并且需要说明的是，采用此方法时，所获得的DNA量通常在微克水平。

祝您的实验顺利。感谢观看。