Name: 使用Qiagen公司的小量制备试剂盒的细菌菌落纯化质粒DNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用Qiagen小量制备试剂盒从细菌菌落中纯化质粒DNA的方法，用于定点突变实验。该方法包括细菌培养、裂解、中和、结合、洗涤和洗脱等步骤，最终获得可用于测序验证突变的高质量DNA。

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作者无任何利益冲突需要披露。

使用qiagen质粒小提试剂盒从细菌菌落中纯化质粒dna

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

从大肠杆菌中纯化质粒DNA是分子克隆的核心技术。从小于5 ml的细菌培养物中进行小规模纯化（质粒小提）是一种快速验证克隆或分离DNA的方法，随后可进行进一步的酶促反应（如聚合酶链式反应和限制性内切酶消化）。本文通过QIAGEN的QIAprep 8 Miniprep试剂盒，对质粒小提的一般操作流程进行了视频记录，旨在向分子生物学技术初学者介绍这一高效的方法。整个流程基于大肠杆菌细胞的碱裂解法，随后在高盐条件下使DNA吸附于二氧化硅基质。该方法包括三个步骤：1）细菌裂解液的制备与澄清，2）DNA在QIAprep膜上的吸附，3）质粒DNA的洗涤与洗脱。所有步骤均无需使用苯酚、氯仿、氯化铯、溴化乙锭，也无需酒精沉淀。通常在2小时以内即可完成全部操作。

关键词：质粒DNA纯化，大肠杆菌，分子克隆，质粒小提，碱裂解法，QIAprep 8 Miniprep试剂盒，二氧化硅吸附，DNA分离

使用Qiagen质粒小提试剂盒从细菌菌落中纯化质粒DNA

从大肠杆菌中纯化质粒DNA是分子克隆的核心技术。小规模纯化（质粒小提）通常从少于5 ml的细菌培养物中进行……

我来自加利福尼亚大学欧文分校生理学与生物物理学系 Mike Halen 的实验室。今天我将向您展示如何使用胶原质微柱来纯化细菌DNA。这是我在进行位点定向诱变实验中的一个步骤。获得质粒后，我将对插入片段进行测序，以确认所选克隆含有预期的突变。在进行小量提取之前，简要回顾一下我们昨天的工作。为了培养细菌，我需要先将5 mL的A LB培养基分别接种到各个试管中。如您所见，在将细菌接种到试管之前，培养基是澄清的。然后我使用移液器从空气平板上挑取单菌落进行接种，并且每次更换枪头，以避免污染。接着将试管放入摇床中，以300 RPM的转速振荡培养至少8小时，通常我们可以过夜培养。胶原蛋白小量制备试剂盒中有三种重要的缓冲液，分别为P一、P二和N三。我们通常将P一置于4摄氏度保存，因为它含有RNase；P二则在室温下放置；N三在实验前八小时左右进行预处理。如您所见，现在的培养基变得浑浊，这是因为其中有细菌生长。我将取5 µL培养基转移到另一块平板上。这样，在确认克隆后，我可以直接回溯到该细菌，而无需再次进行转化实验。离心培养基后，您可以看到试管底部形成了清晰的细菌沉淀，我们会将上清液移除至含漂白剂的容器中，以避免对环境造成污染，而沉淀物仍保留在管中。现在我将缓冲液P1加入细菌沉淀中。P1是重悬缓冲液，用于重悬细菌。接下来，我将用移液器反复吹打溶液，使细菌与缓冲液充分混匀。在此阶段，溶液中不应看到任何细菌菌膜。现在，我将把重悬的细菌转移到一个新的离心管中。我总是会对离心管进行标记，以便追踪并明确每种溶液来自哪个克隆。现在向每根离心管中加入缓冲液P2，缓冲液P2是一种用于裂解细菌的裂解缓冲液。加入缓冲液P2后，可见溶液仍未变澄清。现在将所有离心管颠倒数次，使溶液充分混匀。现在你可以看到溶液变得澄清。接下来，我向每个管中加入缓冲液 N3 和缓冲液 M3，后者为中和缓冲液。一旦加入缓冲液 N3，我立即观察到蛋白质沉淀，但仍需将各管颠倒数次，以充分混匀溶液。充分混匀溶液后，加入缓冲液和三号试剂，应呈现此状态。接下来，我将使用 SGE 在离心机中以 10 分钟的时间离心沉淀蛋白质，我已组装好 Cal VAC six S。我将所有部件按顺序组装好，然后将其连接到真空系统。现在我将校准准备辅助装置的带子固定到歧管上。今天我只进行一个样品，因此我会堵住其他插槽。因此我们已获得良好的真空环境。如您所见，我已根据试管对绑带进行了标记，开启真空后，系统已达到良好的真空状态。好的，离心结束后，您可以看到蛋白质沉淀在管底，而DNA应仍溶解在上清液中。现在进行转移，即含有DNA的上清液，将其转移至硅胶膜条上。需要说明的是，我们每次操作都必须更换吸头，以防止交叉污染。现在打开真空泵。现在关闭真空泵，并加入PB缓冲液洗涤硅胶膜条，此时DNA已结合在膜上。现在，我将PB溶液加入到膜条上以洗涤，此时膜条上仍含有

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使用Qiagen公司的小量制备试剂盒的细菌菌落纯化质粒DNA

本方案为从大肠杆菌（E. coli）培养物中高效并行进行裂解液澄清和质粒DNA纯化提供了一种经济有效的替代方法。AcroPrep...

从原核培养物中简化质粒DNA纯化流程

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真核细胞中外染色体环状DNA的全基因组纯化

本文介绍了基于质粒回收和限制性酶切位点插入的嵌合体组装方法（CAPRRESI），该方案通过将限制性酶切位点插入同义DNA序列并实现功能性质粒的回收。该方法是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合技术。...

CAPRRESI：通过质粒回收与限制性酶切位点插入实现嵌合体组装

本方案描述了使用声波液滴喷射技术在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量质粒转染的方法。耗时且易出错的DNA分配与多重化操作，以及转染试剂的分配，均由软件驱动并通过纳升级分液设备完成。随后将细胞接种至这些预先加样好的孔中。...

利用声波纳米点样技术进行高通量DNA质粒多重化与转染

此处，我们介绍用于操作的实验方案 罗伊氏乳杆菌 DSM20016，详细描述了菌株生长、质粒转化、菌落PCR、荧光报告蛋白检测以及质粒小提的有限操作，同时涵盖常见问题及解决方案。这些实验方案可用于在DSM20016中检测报告蛋白的表达，或进行验证 通过 若不涉及报告基因，则采用菌落PCR。...

Limosilactobacillus reuteri DSM20016 中电穿孔与转化验证的方法

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

本研究描述了一种在染色体序列已知或无需关注时，对质粒进行纳米孔测序的工作流程。初始的质粒DNA富集步骤可确保最佳的质粒测序深度，并最大化每张流动池可测序的样本数量。...

基于纳米孔测序技术流程的长读长质粒测序与组装

学习使用Qiagen小量制备试剂盒从细菌菌落中纯化质粒DNA的方法，用于定点突变实验。该方法包括细菌培养、裂解、中和、结合、洗涤和洗脱等步骤，最终获得可用于测序验证突变的高质量DNA。

使用Qiagen质粒小提试剂盒从细菌菌落中纯化质粒DNA

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