滴流和旋转盘反应器使用金黄色葡萄球菌生物膜分析
December 27th, 2010
详细介绍了利用开放系统流生物膜与滴流反应器和旋转磁盘反应堆的协议。
该程序的总体目标是使用滴流生物膜反应器或旋转盘式反应器在低或中等剪切力下生长细菌生物膜。生物膜中的挂片首先与细菌接种并在 37 摄氏度下孵育以使细菌细胞粘附在生长表面上。一旦细胞附着在细胞片上，生长培养基的流动就开始产生在生物膜形成过程中起作用的纯粹力量。
然后可以收获成熟的生物膜用于生物膜的分析观察。可以使用扫描电子显微镜来确定产生的生物膜的超微结构。我是 Blaze Balls。
流动池等现有方法的这种技术的主要优点是很容易实现高生物量产生和多个相同的生物膜。演示此程序的是 Rachel Stevenson 和 Kelly Schwartz，他们是我实验室的技术人员和研究生。滴流生物膜反应器由四个腔室组成，腔室带有用于介质进入的输入端口和用于废物出口的流出端口。
每个腔室内都有一个可拆卸的试样，生物膜在上面生长。要组装滴流生物膜反应器，请将试样放入每个平行的腔室中并固定腔室盖。使用前对组装好的反应器以及 In Fluent 营养管进行高压灭菌，以对系统进行消毒。
还要高压灭菌生物膜生长培养基以接种灭菌的滴流反应器。将设备放在平坦的表面上并夹住流出物管线。接下来，用 10 毫升无菌三联酱油汤为基础的生长培养基填充每个腔室，并加入 100 微升金黄色葡萄球菌。
过夜培养物在同一培养基中分别生长到每个腔室中。将接种的反应器置于 37 摄氏度的培养箱中 18 小时，使细胞粘附在试样表面。孵育后，UNC 夹住流出管，将反应器放在倾斜的木块切割机上，形成 10 度角。无 菌。
将 Fluent 营养管连接到装有连续流动营养肉汤的瓶子上。将管道管路送入泵中，并通过全速运行泵来灌注管道。灌注流利管后，停止泵并将 22 号的 1 英寸针头连接到每根管的末端。
用乙醇湿巾在无菌条件下擦拭腔室入口塞。将针插入进样口塞。打开泵，让培养基滴在试样上。
在大约每分钟 125 微升的流速下，介质应从入口塞端口向至流出口。以连续流方式运行反应器三天。偶尔检查反应器是否排水正常。
通过目视检查腔室来检查排水情况，以确保介质不会在腔室中积聚。如果介质积聚、挤压，流出管通常会促进适当的排水以收集生物膜，停止泵并从反应器中取出针头。然后将反应器放在平坦的表面上。
连续流动三天后，金黄色葡萄球菌生物膜显示为黄色生物量沿接种试样的长度扩散。生物膜的扫描电子显微照片显示金黄色葡萄球菌覆盖了表面相关生物膜群落中的挂片。为了量化获得的生物量，使用无菌镊子进行消毒，去除试样，使用细胞刮刀收获细菌，然后将它们转移到含有 5 毫升无菌 PBS 的锥形管中。
使用组织，匀浆器解聚细菌团块，直到获得均匀的悬浮液。通过将连续稀释液接种到三联酱干平板上，在 37 摄氏度下孵育 24 小时并计数菌落，对菌落形成单位进行定量。转盘生物膜反应器由一个化学装置组成，生长培养基通过该装置泵送。
一个带有星形条和 18 张优惠券的旋转盘，旨在安装在旋转盘中。要先组装反应器，请将旋转盘试样装入旋转盘的插槽中。接下来，将装载的圆盘放入带有溢流口的 1 升玻璃烧杯中，并用 15 号橡胶塞盖住反应器，该橡胶塞有一个用于介质流动的孔和一个用于曝气的孔。
高压灭菌器、组装的反应器和入口管，用于对系统进行灭菌。要接种反应器，请在烧杯中加入 250 毫升无菌培养基，并加入 500 微升在三联大豆汤中生长的金黄色葡萄球菌过夜培养物。将反应器放在每分钟 250 转的搅拌板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜，以使细胞粘附在试样上。
过夜孵育后，将进样管连接到培养基储液槽上的端口和蠕动泵。打开泵，将流速设置为每分钟 0.25 毫升。让反应器在 24 摄氏度下运行 37 小时，以收获所得的生物膜。
停止反应器并无菌。在不接触试样的情况下取出光盘。使用无菌镊子取出试样，小心地将每个试样浸入无菌 PBS 中，以去除松散附着的细菌，用于抗菌化合物检测。
在无菌条件下，将试样放入含有目标化合物的 96 孔板的各个孔中。将板在 37 摄氏度下孵育 4 小时。然后将试样转移到含有 1 倍 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中，并使用均质器分散生物膜。
最后，如前所述，在营养琼脂培养基上对细胞进行连续稀释，以确定每个样品的活菌落形成单位的数量。该图显示了使用旋转盘式反应器制备并暴露于过氧化氢的生物膜中菌落形成单元的数量，能够产生多达 18 个相同的生物膜。使用转盘式反应器使该技术成为抗菌化合物测试的理想选择。
观看此视频后，您应该对如何运行滴流和旋转盘式反应器生物膜有很好的了解。这些生物膜反应器提供了流通池和微量滴定板生物膜的替代方案，是需要大量生物膜生物量或需要对已建立的生物膜进行抗菌测试时的理想选择。
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概述
本文介绍了使用滴流反应器和旋转盘反应器培养细菌生物膜的协议。这些程序详细说明了如何将细菌接种到试样上，以及在受控剪切力下生物膜的随后发展。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物膜工程
- 生物技术
背景
- 细菌生物膜是粘附在表面的复杂群落。
- 理解生物膜的发展对各种应用至关重要。
- 剪切力影响生物膜的结构和功能。
- 不同的反应器设计可以影响生物膜的生长动态。
研究目的
- 提供详细的生物膜生长协议。
- 比较滴流和旋转盘反应器的效果。
- 促进成熟生物膜的分析。
使用的方法
- 用细菌细胞接种试样。
- 在37摄氏度下孵育以促进粘附。
- 流动培养基在发展过程中产生剪切力。
- 使用扫描电子显微镜分析生物膜。
主要结果
- 在特定条件下成功培养细菌生物膜。
- 比较不同反应器类型的生物膜结构。
- 洞察剪切力对生物膜形态的影响。
- 使用电子显微镜对生物膜进行详细成像。
结论
- 所概述的协议对生物膜研究有效。
- 反应器的选择显著影响生物膜的特性。
- 进一步的研究可以在这些方法的基础上进行高级应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antimicrobial hypotheses in disease-relevant biofilm models.
- Supports functional validation of anti-biofilm targets and materials.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling shear and growth conditions.
- Provides reproducible platforms for portfolio triage of candidate compounds.
Screening & Assay Development
- Generates standardized, high-biomass biofilms for quantitative compound evaluation.
- Enables parallel production of identical biofilm samples for reproducibility.
- Supports scalable screening of antimicrobial efficacy and material performance.
- Delivers quantitative outputs such as colony forming units for assay comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with clinically relevant device and material testing.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-biofilm strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on robust biofilm challenge data.
- Provides mechanistic insight into biofilm resilience and removal under defined shear.
Pipeline & Workflow Integration
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antimicrobial and anti-fouling interventions in controlled biofilm systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biofilm assays for compound and material evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colony forming units and biofilm biomass for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with device and material testing relevant to clinical applications.
- Enterprise Reuse: Offers standardized, scalable platforms for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-biofilm efficacy and material performance.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm production workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective and device portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust biofilm data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biofilm quantification.
- Needs access to specialized reactors, incubators, and analytical tools such as homogenizers and microscopy.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- Adaptable to various coupon materials and device-relevant surfaces.
- Limited to in vitro modeling; translation to in vivo systems requires further validation.
