Name: 滴流和旋转盘反应器使用金黄色葡萄球菌生物膜分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用滴流反应器和旋转盘反应器培养金黄色葡萄球菌生物膜，在37摄氏度下接种培养并控制剪切力生长。该方法可实现高生物量产率和多重相同生物膜制备，适用于抗菌药物测试和生物膜结构分析。

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美国国家过敏与传染病研究所资助项目 K22AI081748。

1. 滴流生物膜反应器
<ol>
<li>滴流生物膜反应器（可从 Biosurface Technologies 购买，或由大学机加工车间定制设计，见图1）组装后进行高压灭菌。组装过程包括将试片固定在反应室中，并密封反应室盖。反应室、生物膜培养基（胰蛋白胨大豆肉汤 2 克/升和葡萄糖 2 克/升）以及进液营养管路均通过高压灭菌进行灭菌。</li>
<li>通过将反应器置于水平台面上，夹紧出液管路，向每个反应室中加入 10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤，并添加 10 μL 在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的 S. aureus 菌液，完成滴流反应器的接种。接种后的反应器随后置于 37°C 培养箱中培养 18 小时。</li>
<li>培养 18 小时后，松开出液管路夹子，将反应器放置在切割成 10° 倾角的木块上。</li>
<li>无菌连接进液营养管路至含有连续流动营养肉汤的瓶子。将管路穿过蠕动泵，并以最大流速（根据泵型号不同而异）运行泵，以排尽管路中的气泡并完成预灌注。</li>
<li>进液管路预灌注完成后，停止泵运行，并在每根管路末端连接穿刺针（22 号，1 英寸）。用乙醇棉片擦拭反应室进液口橡胶塞，然后无菌操作将穿刺针穿过橡胶塞插入。</li>
<li>启动泵，使培养基缓慢滴流（流速约 125 μL/分钟）流过试片表面。培养基应从进液口沿试片表面向下流向出液口。连续流动运行反应器 2 至 5 天（根据实验需求而定），期间应定期检查反应器的排水情况是否正常。</li>
<li>收获滴流反应器中的生物膜时，先停止泵运行，并小心地将穿刺针从反应器上移除。随后将反应器置于水平台面上，使用无菌镊子无菌取出试片。如需进行显微观察，可按相应方法处理试片（图 2B 为在滴流生物膜反应器中培养的 S. aureus 生物膜的扫描电子显微照片）。若实验目标为定量生物膜生物量或进行生理学研究，可使用细胞刮刀将生物膜从试片上刮下。操作时用镊子夹持试片，用细胞刮刀轻轻将生物膜刮入含有磷酸盐缓冲液的锥形管中。注意：若需定量生物膜中的菌落形成单位，必须使用组织匀浆器对收获的生物膜进行均质化处理，以分散菌团并形成均匀悬液。多种型号的组织匀浆器均适用于此操作。我们采用 Fisher Scientific Tissuemiser 匀浆器（产品编号 # 15-338-420）以全速运行 1 分钟对生物膜样品进行匀浆。若未对生物膜进行匀浆处理，将导致样品中菌落形成单位数量被低估。</li>
</ol>
2. 旋转圆盘生物膜反应器
<ol>
<li>旋转圆盘生物膜反应器（可从 Biosurface Technologies 购买，或可定制，见图3）组装后进行高压灭菌。首先将旋转圆盘试片插入旋转盘的插槽中，并将其放入带有溢流口的1升玻璃烧杯内，完成反应器的组装。使用带有钻孔的15号橡胶塞作为反应器盖，以允许培养基流动和通气。随后，将反应器、生物膜培养基（胰蛋白胨大豆肉汤 2 g/L 和葡萄糖 2 g/L）以及进样管路通过高压灭菌进行灭菌。</li>
<li>通过向反应器中加入250 mL无菌培养基，并添加0.5 mL在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的S. aureus菌液，对旋转圆盘生物膜反应器进行接种。然后将反应器置于设定为250 rpm的磁力搅拌台上，并在所需温度下过夜培养。</li>
<li>培养16小时后，将进样管路连接至培养基储液瓶的接口，并连接至蠕动泵。启动泵并将流速设定为约0.25 mL/min（可根据所需生长速率调整流速）。</li>
<li>24小时后停止反应器运行，并以无菌操作方式取出圆盘，避免触碰生物膜试片。使用无菌镊子取下试片，并将其逐一浸入磷酸盐缓冲液中，以去除松散附着的细菌。</li>
<li>对于抗菌化合物测试，可将芯片置于含有待测化合物的96孔板的各个孔中。培养后，将芯片转移至含有1 mL磷酸盐缓冲液的1.5 mL微量离心管中，并使用组织匀浆器进行匀浆，以分散完整的生物膜。</li>
<li>随后对细胞进行系列稀释，并接种于营养琼脂培养基上，以测定可存活的菌落形成单位。</li>
<li>注意：上述方案可进行多种变异。例如，可将旋转圆盘试片涂覆或直接由潜在的抗生物膜化合物制成，以测试其功效。也可通过将试片在分散剂化合物中孵育，并定量附着与脱离的细菌，来评估生物膜分散剂的效果。</li>
</ol>	 
3. 典型结果
图1展示了一个滴流反应器的设置示例。在持续流动三天后，试片表面会积聚大量生物膜，如图2A所示。总生物量会因细菌菌株和具体的生长条件不同而有所变化。图2B显示了在滴流反应器中培养的S. aureus生物膜的扫描电子显微照片。
旋转圆盘反应器如图3A所示。所述方案可针对通常任何能够形成生物膜的微生物的具体需求进行调整。图3B显示了固定有18个塑料圆盘的旋转圆盘。在这些圆盘上生长的生物膜特别适用于抗菌测试，并可获得高度可重复的结果11。
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="用于生物膜生长的滴流反应器装置，包含培养基瓶、泵系统和废液收集装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 滴流反应器装置示意图。重要组件已标注。
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="微生物腐蚀实验装置及扫描电镜结果；两幅图像中均可观察到金属降解现象。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 滴流式 S. aureus 生物膜示例。A) 该生物膜按照所述方案培养三天。反应器前两个腔室的盖子已被移除，以显示黄色的 S. aureus 生物膜生物量。B) 在滴流反应器中培养的 S. aureus 生物膜的扫描电子显微图像。
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="用于培养基处理的旋转圆盘反应器装置；搅拌板、泵、废液管理；顶视图试片。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 旋转圆盘反应器。A) 运行中的旋转圆盘反应器示例，关键组件已标注。B) 旋转圆盘的放大视图。

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signaling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Micro%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li>
<li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li>
<li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+diversity+produces+%22insurance+effects%22+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li>
<li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li>
<li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在不同反应器中培养的生物膜通常具有不同的特性，且每种反应器具有不同的应用。本研究中，我们描述了两种生物膜反应器的使用：滴流生物膜反应器和旋转圆盘反应器。滴流反应器适用于在气液界面培养低剪切力生物膜，并可适应多种条件。我们发现，当需要大量生物膜生物量时，该反应器极为方便。该装置还可轻松改造，用于涉及微传感器监测以及潜在抗生物膜表面测试的研究。
旋转圆盘反应器可用于在可移除的圆盘上、中等剪切力环境下培养多个相同的生物膜。该反应器能够在可拆卸圆盘上生成多个一致的生物膜，因此非常适用于抗菌化合物和抗生物膜表面的研究。使用此类生物膜反应器具有多种应用可能，研究人员可依据具体研究需求对实验方案进行适当修改。
这些方案为过去更常使用的流动池和静态生物膜实验提供了替代方法，也可能更有效地模拟多种临床感染情况。然而，每种技术都可能存在一定的局限性。例如，滴流反应器和旋转盘反应器并不适合通过共聚焦显微镜观察生物膜。此外，在不同类型反应器中培养的生物膜其生理状态可能存在显著差异。以滴流反应器为例，其形成的生物膜会暴露于严重的营养梯度环境中，这与...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>滴流式反应器</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>旋转盘反应器</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

自然界中的大多数微生物被认为以生物膜中的表面相关群落形式存在。1 细菌生物膜被包裹在基质中，并附着于表面。2 生物膜的形成与发展通常在实验室中通过分批系统（如微量滴定板）或流动系统（如流动池）进行研究。这些方法适用于突变体和化合物文库的筛选（微量滴定板）3，或用于培养可供观察的生物膜（流动池）4。本文详细介绍了在另外两种流动系统生物膜装置中培养Staphylococcus aureus的实验方案：滴流生物膜反应器和旋转盘生物膜反应器。
滴流式生物膜反应器专为研究在低剪切力条件下生长的生物膜而设计。5 该反应器包含四个平行的测试通道，每个通道可容纳一个标准尺寸的玻璃显微镜载玻片状试片，或一段导管或支架。滴流式反应器非常适合用于微传感器监测、常规生物膜研究、生物膜冷冻切片样品制备、高生物量生产、医用材料评估以及植入性医疗器械的测试。6,7,8,9
旋转圆盘反应器由一个聚四氟乙烯圆盘构成，圆盘上设有用于放置可拆卸试片的凹槽。10 可拆卸试片可由任何可加工材料制成。旋转圆盘底部装有一块条形磁铁，通过磁力驱动圆盘旋转，从而在与表面齐平的试片上产生液体表面剪切力。整个圆盘可容纳18个试片，将其置于一个1000 mL带侧臂的玻璃反应容器中。在圆盘由磁力搅拌器驱动旋转的同时，液体培养基在容器内循环流动。实验结束后，将试片从反应容器中取出，刮取其表面生物膜样品，用于进一步研究或显微成像分析。旋转圆盘反应器主要用于实验室条件下评估杀菌剂效力、生物膜去除效果以及防污材料的性能。9,11,12,13

详细介绍了利用滴流反应器和旋转盘反应器构建开放式系统流动生物膜的实验方案。

用于Staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

自然界中的大多数微生物被认为以生物膜中的表面相关群落形式存在。1 细菌生物膜被包裹在基质中，并附着于……

本实验的总体目标是利用滴流式生物膜反应器或旋转圆盘反应器，在低或中等剪切力条件下培养细菌生物膜。在生物膜反应器中，首先将细菌接种于试片上，并在37摄氏度下孵育，以使细菌细胞附着于生长表面。一旦细胞附着到试片上，即开始通入培养基，产生贯穿生物膜发育过程的剪切力。随后可收获成熟的生物膜用于分析和观察。可采用扫描电子显微镜观察所形成的生物膜的超微结构。我是Blaze Balls。该技术相较于现有方法（如流动池）的主要优势在于能够轻松实现高生物量的产生以及多个相同的生物膜。本次实验操作将由本实验室的技术员 Rachel Stevenson 和研究生 Kelly Schwartz 进行示范。滴流式生物膜反应器包含四个腔室，设有培养基输入口和废液流出口。每个腔室内部均有一个可移除的试片，用于生物膜的生长。组装滴流式生物膜反应器时，将试片放入各个平行腔室中，并固定腔室盖。使用前，将组装好的反应器以及进液营养管路一同进行高压灭菌，以对系统进行灭菌处理。同时将用于接种已灭菌滴流反应器的生物膜培养基进行高压灭菌。将装置置于平坦表面上，并夹紧流出管路。接着，向每个腔室加入10毫升无菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，并添加100微升金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。在相同培养基中过夜培养后，分别接种至每个腔室。将接种后的反应器置于37摄氏度培养箱中培养18小时，以使细胞贴附于试片表面。培养结束后，在无菌条件下夹闭出液管路，并将反应器放置于倾斜的木块上，使其成10度角。将营养液管路连接至含有连续流动营养肉汤的瓶子。将管路穿过蠕动泵，并以全速运行泵以排尽管路中的气泡。待营养液管路排空后，停止泵运转，并在每根管路末端安装22号一英寸长的针头。用乙醇擦拭垫片并进行无菌操作，擦拭培养室入口塞。将针头穿过入口塞。打开泵，使培养基滴在试片上。在约 125 微升/分钟的流速下，培养基应从入口塞端口向下流至流出端口。使反应器连续流动运行三天，并偶尔检查反应器以确保正常排水。通过目视检查腔室来确认引流情况，以确保培养基未在腔室内积聚。若发现培养基积聚，通常可通过夹闭流出管路来促进正常引流。收集生物膜后，停止泵运行，并从反应器上移除针头，随后将反应器置于平坦表面上。连续流动三天后，金黄色葡萄球菌生物膜呈现为沿接种片表面分布的黄色生物量。生物膜的扫描电子显微镜图像显示，金黄色葡萄球菌在材料表面形成了与表面相关的生物膜群落。为了定量获得的生物量，需使用无菌镊子以无菌操作方式取出接种片，用细胞刮刀收集细菌，然后将其转移至含有 5 mL 无菌 PBS 的锥形管中。使用组织匀浆器将细菌团块研磨分散，直至获得均匀的悬浮液。通过将系列稀释的菌液涂布于三联萨格尔培养基平板，于37摄氏度培养24小时后计数菌落，以确定菌落形成单位。旋转圆盘生物膜反应器由一个化学恒化器组成，生长培养基通过该恒化器被泵入。 一个带有星形转轴和18个试片的旋转圆盘，试片设计为可插入旋转圆盘的槽中。组装反应器时，首先将试片装入旋转圆盘的槽内。然后将装有试片的圆盘放入一个带溢流口的1升玻璃烧杯中，并用带有两个孔的15号橡胶塞密封反应器：一个孔用于培养基流动，另一个孔用于通气。将组装好的反应器和进样管路进行高压灭菌以灭菌系统。接种反应器时，取250毫升无菌培养基加入烧杯中，并添加500微升在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌液。将反应器置于搅拌台上，设置转速为每分钟250转，在37摄氏度下过夜培养，使细胞贴附于试片表面。过夜培养后，将进液管连接到培养基储液罐的端口和蠕动泵上。打开泵，将流速设定为0.25毫升每分钟。让反应器在37°C下运行24小时，以收获形成的生物膜。停止反应器并进行无菌操作。取出圆盘时避免接触试片。使用无菌镊子取下试片，并将其逐一小心浸入无菌 PBS 中，以去除松散附着的细菌，用于抗菌化合物检测。无菌操作下，将试片放入含有待测化合物的96孔板的各个孔中。在37摄氏度下孵育4小时。然后将试片转移至含有1倍PBS的1.5毫升微量离心管中，并使用均质器分散生物膜。最后，将细胞在营养琼脂培养基上进行系列稀释涂布，以测定每份样品中可存活的菌落形成单位数量，具体操作如前所述。该图显示了使用旋转圆盘反应器制备并暴露于过氧化氢的生物膜中的菌落形成单位数量，该系统能够同时生成多达18个相同的生物膜。使用旋转圆盘反应器使该技术成为抗菌化合物测试的理想选择。观看本视频后，您应能够充分了解如何运行滴流式和旋转圆盘反应器中的生物膜。这些生物膜反应器为流动池和微孔板生物膜提供了替代方案，在需要大量生物膜生物量或需对成熟生物膜进行抗菌测试时尤为理想。

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