用于Staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

本实验的总体目标是利用滴流式生物膜反应器或旋转圆盘反应器，在低或中等剪切力条件下培养细菌生物膜。在生物膜反应器中，首先将细菌接种于试片上，并在37摄氏度下孵育，以使细菌细胞附着于生长表面。一旦细胞附着到试片上，即开始通入培养基，产生贯穿生物膜发育过程的剪切力。

随后可收获成熟的生物膜用于分析和观察。可采用扫描电子显微镜观察所形成的生物膜的超微结构。我是Blaze Balls。

该技术相较于现有方法（如流动池）的主要优势在于能够轻松实现高生物量产出以及多个相同的生物膜。演示本实验操作的将是来自我实验室的技术员瑞秋·史蒂文森（Rachel Stevenson）和研究生凯利·施瓦茨（Kelly Schwartz）。滴流生物膜反应器包含四个腔室，每个腔室均设有培养基输入口和废液流出口。

每个腔室内部均有一个可移除的试片，用于生物膜的生长。组装滴流式生物膜反应器时，将试片放入各个平行腔室中，并固定腔室盖。使用前，将组装好的反应器以及进液营养液管路一同进行高压灭菌，以对系统进行灭菌。

同时将用于接种已灭菌滴流反应器的生物膜培养基进行高压灭菌。将装置置于平坦表面上，并夹紧流出管路。接着，向每个腔室加入10毫升无菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，并添加100微升金黄色葡萄球菌。

在相同培养基中分别接种各腔室并过夜培养。将接种后的反应器置于37摄氏度培养箱中培养18小时，以使细胞贴附于试片表面。培养结束后，在无菌条件下夹闭出液管路，并将反应器放置于倾斜的木块上，使其成10度角。

将营养液管路连接至含有连续流动营养肉汤的瓶子。将管路穿过蠕动泵，并以全速运行泵以排尽管路中的气泡。待营养液管路排尽气泡后，停止泵的运行，并在每根管路末端安装22号一英寸长的针头。

用乙醇擦拭垫片并进行无菌操作，擦拭培养室入口塞。将针头穿过入口塞。打开泵，使培养基滴在样品片上。

在约 125 微升/分钟的流速下，培养基应从入口塞端口向下流向流出端口。使反应器连续流动运行三天，并偶尔检查反应器以确保排水正常。

通过目视检查腔室来确认引流情况，以确保培养基未在腔室内积聚。若发现培养基积聚，通常可通过夹闭流出管路来促进正常引流。收集生物膜后，停止泵运行，并从反应器上移除针头，然后将反应器置于平坦表面上。

连续流动三天后，金黄色葡萄球菌生物膜呈现为沿接种片表面分布的黄色生物量。生物膜的扫描电子显微镜图像显示，金黄色葡萄球菌在材料表面形成了与表面相关的生物膜群落。为了定量所获得的生物量，需使用无菌镊子以无菌操作方式取出样本片，用细胞刮刀收集细菌，然后将其转移至含有5 mL无菌PBS的锥形管中。

使用组织匀浆器将细菌团块研磨分散，直至获得均匀的悬浮液。通过将系列稀释的菌液涂布于三联琼脂平板，在37摄氏度下培养24小时后计数菌落，以确定菌落形成单位。旋转圆盘生物膜反应器由一个化学恒化器组成，生长培养基通过该恒化器被泵入系统。

一个带有星形搅拌棒和18个试片的旋转圆盘，试片设计为可插入旋转圆盘中。组装反应器时，首先将旋转圆盘试片装入旋转圆盘的插槽中。然后将装有试片的圆盘放入一个带溢流口的一升玻璃烧杯中，并用一个15号橡胶塞密封反应器，橡胶塞上有两个孔，一个用于培养基流动，另一个用于通气。

将组装好的反应器及进样管路进行高压灭菌以灭菌系统。接种反应器时，取250毫升无菌培养基加入烧杯中，并添加500微升在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌液。将反应器置于搅拌台上，设置转速为每分钟250转，在37摄氏度下过夜培养，使细胞贴附于试片表面。

经过过夜孵育后，将进液管连接到培养基储液罐的接口和蠕动泵上。打开泵，将流速设定为0.25毫升每分钟。使反应器在37摄氏度下运行24小时，以收集生成的生物膜。

停止反应器并进行无菌操作。取出圆盘时避免接触试片。使用无菌镊子取下试片，并将其逐一小心浸入无菌 PBS 中，以去除松散附着的细菌，用于抗菌化合物检测。

无菌操作下，将试片放入含有待测化合物的96孔板的各个孔中。在37摄氏度下孵育4小时。然后将试片转移至含有1倍PBS的1.5毫升微量离心管中，并使用均质器分散生物膜。

最后，将细胞在营养琼脂培养基上进行系列稀释涂布，以测定每份样品中可存活的菌落形成单位数量，具体操作如前所述。该图显示了利用旋转圆盘反应器制备并暴露于过氧化氢的生物膜中的菌落形成单位数量，该系统能够同时生成多达18个相同的生物膜。使用旋转圆盘反应器使该技术非常适合用于抗菌化合物的测试。

观看本视频后，您应能充分了解如何运行滴流式生物膜反应器和旋转圆盘反应器中的生物膜。这些生物膜反应器为流动池和微孔板生物膜提供了替代方案，尤其适用于需要大量生物膜生物量，或需对成熟生物膜进行抗菌测试的情况。