病毒蚀斑实验中液体覆盖系统的评估

取一个含上皮细胞单层的多孔板，向各孔中加入病毒悬液。

偶尔轻轻摇动培养，使病毒均匀分布。病毒附着并进入细胞。

在一个孔中加入熔化的琼脂糖，其会凝固形成半固体覆盖层。

在另一孔中加入基于微晶纤维素的黏稠液体覆盖层，并进行孵育。其黏度可限制病毒扩散，作用类似于半固体覆盖层。

在细胞内，病毒释放其基因组并产生新的病毒RNA和蛋白质。

新病毒组装、离开细胞并导致细胞裂解。

释放的病毒会感染邻近细胞，形成空斑。

吸除液体覆盖层，加入固定剂以保存未裂解的细胞。

弃去固定液并移除琼脂糖覆盖层。

加入可染色活细胞的染料，使空斑保持未染色状态，然后洗去多余的染料。

液体覆盖层在空斑形成数量上与半固体覆盖层相当，支持其作为空斑试验中的一种替代方法。

铺板后的第二天，使用倒置显微镜检查细胞的融合度和活力，以确定是否适合开始实验。确保细胞呈现标准的细胞形态，并达到约90%的融合度。

用细胞培养基对感染性样品进行10倍系列稀释，稀释梯度的数量根据待测病毒的预期滴度进行调整。同时，制备未感染的对照样品，以独立确认细胞的存活率，并辅助识别蚀斑。将未感染的对照样品和系列稀释液加入到培养板的孔中，注意避免破坏单层细胞。

加入足够体积的接种物以覆盖细胞，同时尽量减少体积，以最大化病毒与单层细胞的接触。将培养板放入组织培养箱中，感染细胞45分钟至1小时。每20分钟轻轻摇动培养板，以确保接种物均匀分布，并防止细胞单层干燥。

感染期间，准备用于液体覆盖层的工作液。将预热的噬斑培养基与室温下的1.2%至2.4% Stock Avicel 按1:1比例混合，配制成终浓度为0.6%至1.2%的Avicel覆盖培养基工作液。对于琼脂糖或CMC覆盖层，将预热的噬斑培养基与加热后的0.6%琼脂糖或2% CMC储存液按1:1比例混合。随后置于56摄氏度水浴中，平衡温度30分钟。确保溶液温热但不烫手，以防止细胞死亡和病毒滴度降低。感染完成后，将覆盖层加入已感染的单层细胞中。加入覆盖层后，根据所分析病毒的不同，将培养板在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2至14天。

使用液体覆盖层固定细胞时，先倒出或吸出Avicel覆盖层，然后用移液器将10%甲醛溶液加入孔中，在室温下固定30分钟至过夜。对于琼脂糖或羧甲基纤维素（CMC）覆盖层，则直接将甲醛溶液加入覆盖层中，在室温下固定1小时至过夜。固定完成后，弃去甲醛溶液，然后用刮刀手动移除琼脂糖形成的半固体凝块。

在染色前，用水冲洗Avicel细胞斑块，以去除残留的覆盖层固定剂。

染色时，加入少量结晶紫溶液覆盖细胞，作用约15分钟。必要时轻轻晃动培养板，以确保染色均匀。用清水轻轻洗去结晶紫染料。固定、染色并干燥后，可将蚀斑长期保存，用于后续分析。