Name: 鼠标涎腺干细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习使用酶解和机械消化法从小鼠颌下腺分离唾液腺干细胞，并通过过滤和培养获得具有干细胞特性的唾液球。该方法为再生医学和口干症治疗研究提供了可靠的技术基础。

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1. 	试剂的配制
<ol>
<li>缓冲液：1 % (w/v) 牛血清白蛋白的 Hank's 平衡盐溶液</li>
<li>重悬酶。透明质酸酶：40 mg/mL，溶于缓冲液中；胶原酶 II：23 mg/mL，溶于缓冲液中。每次分离均需使用新鲜配制的酶溶液。溶解后，于 4 °C 保存，用于后续消化。</li>
<li>50 mM 氯化钙水溶液。使用 0.2 μm 孔径滤器过滤除菌。</li>
<li>小鼠唾液腺（MSG）培养基：DMEM:F12 培养基，含青霉素（100 I.U./mL）、链霉素（100 μg/mL）、谷氨酰胺（2 mM）、表皮生长因子-2（20 ng/mL）、成纤维细胞生长因子-2（20 ng/mL）、N2 添加剂（1 %）、胰岛素（10 μg/mL）和地塞米松（1 μM）。</li>
</ol>
2. 机械法与酶解法组织消化
<ol>
<li>称量解剖得到的唾液腺组织。</li>
<li>在小型培养皿中，使用无菌弯头解剖剪将腺体组织切碎成均匀的浆状物。</li>
<li>将切碎的组织收集至14 mL离心管中，每80 mg下颌下腺组织加入1 mL缓冲液。用部分缓冲液冲洗培养皿，确保组织完全转移。</li>
<li>每80 mg组织再加入1 mL缓冲液，随后分别加入25 μL胶原酶II酶溶液、25 μL透明质酸酶酶溶液和250 μL氯化钙溶液。若处理大量组织，为方便操作，步骤2.4–2.9可在T25细胞培养瓶中进行。</li>
<li>置于37 °C振荡水浴中孵育20分钟。取出离心管，用移液器吹打混匀，使酶液充分与组织混合。</li>
<li>再次放回水浴中继续孵育20分钟。</li>
<li>以400 × g离心8分钟收集组织，弃去上清液。</li>
<li>每80 mg组织用2 mL缓冲液重悬，并按上述方法重复加入酶溶液和氯化钙溶液。在振荡水浴中孵育20分钟。取出离心管，用移液器吹打混匀，确保酶充分混合。</li>
<li>最后在振荡水浴中继续孵育20分钟。按上述方法离心收集细胞，弃去上清液。</li>
</ol>
3. 洗涤步骤
<ol>
<li>将每份80 mg组织重悬于2 mL缓冲液中，用移液器吹打洗涤，以去除酶。</li>
<li>按前述方法离心收集，弃去上清液。</li>
<li>每80 mg组织用1 mL缓冲液重复洗涤一次，离心收集，弃去上清液。</li>
</ol>
4. 过滤
<ol>
<li>每 80 mg 组织用 1 mL 缓冲液重悬组织溶液。</li>
<li>将溶液加入置于 50 mL Falcon 管上的 100 μm 孔径滤器中。每个滤柱中加入的剪碎组织溶液不得超过 3 mL，以免滤器堵塞。让溶液自然渗滤。用移液器收集滤器底面悬挂的滤过物质，并加入滤液中。</li>
<li>使用带 26 号针头的注射器从 50 mL 管中吸取滤液，然后加至 5 mL 管上的 50 μm 孔径滤器中。让其自然过滤，必要时可稍微松开管盖以促进过滤。</li>
<li>按前述条件离心收集细胞。弃去上清液。</li>
</ol>
5. 铺板与培养基
<ol>
<li>将所有沉淀合并为一个体积，使用自动细胞计数器或血细胞计数板进行计数。</li>
<li>以每孔 0.4 × 106 个细胞的密度将细胞接种至 12 孔板中，或以每瓶 T25 培养瓶 2.67 × 106 个细胞的密度接种。每孔加入 1 mL MSG 培养基，每只 T25 培养瓶加入 6 mL。</li>
<li>在 37 °C 条件下培养。至第 2 天时，细胞球应清晰可见。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
培养两到三天后，培养物中将出现细胞小聚集体（唾液腺球）。唾液腺球在培养期间可持续增大，十天内可明显观察到其生长。图1展示了唾液腺球的代表性相差显微镜图像。这些球体中可分离出表达干细胞相关标志蛋白的增殖细胞，最佳分离时间为分离后的第3至第5天，这些细胞具有分化为功能性唾液分泌性腺泡细胞的能力。
<img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="培养10天的细胞生长情况；第0、4、7、10天的显微镜图像；细胞簇形成。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 唾液腺球体形成 体外在使用本方案进行机械和酶消化后，可在悬浮培养物中观察到尺寸逐渐增大的球状结构。各图为代表性的相差显微镜图像，分别显示培养第0天（A）、第4天（B）、第7天（C）和第10天（D）的球状结构。比例尺 = 50 μm.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

此处描述的组织培养方法是一种可重复的实验方案，用于从小鼠唾液腺中分离含有干细胞的唾液腺球体。采用此方法分离的细胞所开展的研究已揭示了唾液腺干细胞的再生能力。 9移植100个来源于涎腺球的c-Kit+细胞可诱导辐照小鼠涎腺功能恢复。这些数据令人振奋，为开展基于干细胞治疗口干症的研究提供了起点。然而，仍有许多方向有待探索，包括干细胞的完整标志蛋白表达谱、下颌下腺是否能够挽救辐照后腮腺的功能（反之亦然），以及假定的 体内 细胞的干细胞微环境。最终，将该方案应用于人类组织样本，并利用分离出的细胞治疗人类患者的口干症，是所述方法最具前景的应用方向。

<table><tbody><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>于 &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C 保存</td></tr><tr><td>胶原酶 II</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>17101-015</td><td>于 4 &amp;#x00B0;C 保存</td></tr><tr><td>表皮生长因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成 10 &amp;#x03BC;g / mL 的储存液。分装成单次使用量，于 &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>用 PBS 配制成 25 &amp;#x03BC;g / mL 的储存液。分装成单次使用量，于 &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C 保存。</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>17502-048</td><td>按照生产商说明书操作。</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>用自来水配制成 2 mg / mL 的储存液。溶解前，用冰醋酸将水调节至 pH 2–3。</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>孔径为 100 &amp;mu;M 的无菌细胞筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的聚苯乙烯圆底管（孔径 50 &amp;mu;M）</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠唾液腺干细胞的分离

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

人类和小鼠成熟的唾液腺至少包含五种细胞类型，每种细胞均参与唾液的生成并将其排入口腔。浆液性和黏液性腺泡细胞分别是腺体中蛋白质和黏液的生产单位，是唾液生成的起始部位。一旦合成，唾液中的各种酶类及其他蛋白质成分便通过一系列具有上皮样形态的导管细胞进行分泌，最终经由一条主要导管排入口腔。在此过程中，导管细胞还会对唾液的成分进行修饰。
在干燥综合征等疾病的发生过程中，以及头颈部癌症的放射治疗等某些临床情况下，唾液腺的唾液分泌量显著减少1,2。由此产生的口干症（主观感受到的口腔干燥）不仅影响患者吞咽和说话的能力，还会促进龋齿的发展，对患者的社会生活造成严重困扰。
因此，在上述临床状况下恢复唾液分泌代表了一项尚未满足的临床需求，已有若干研究证明唾液腺具有再生能力3-5。继从小鼠和人体多种组织中分离出具有干细胞特性的细胞群体之后6-8，我们通过所述方法证实，从小鼠唾液腺中分离的干细胞可用于恢复经辐射损伤的唾液腺的唾液分泌功能9,10。这一发现为开发基于干细胞的疗法以治疗人类口干症提供了可能，同时也为进一步探索唾液腺作为含有具有多向分化潜能和自我更新能力细胞的微环境奠定了基础。

本文介绍了一种从小鼠唾液腺中分离干细胞的优化方案。该方法结合酶消化与机械消化，可分离获得含有具有干细胞特征细胞的唾液腺球状体（salispheres）。

人类和小鼠来源的成熟唾液腺至少包含五种细胞类型，每种细胞均参与唾液的生成与分泌……

本实验的总体目标是演示从神经SIV腺体中分离出潜在干细胞的方法。首先从成年小鼠中获取下颌下唾液腺组织，完成第一步。实验的第二步是使用弯头剪刀将组织处理成均匀的浆状物。该操作步骤的第三步是使用胶原酶和更高浓度的解离酶进一步消化组织。应注意避免过度消化组织。由于完全的单细胞悬液所形成的球体数量较少，因此含有两到三个细胞的细胞簇为最佳状态。该实验步骤的最后一步是将匀浆液依次通过100微米和50微米的滤膜进行过滤。最终可获得结果，显示通过机械法与酶消化法联合处理完整的下颌下腺，能够实现下颌下腺干细胞的培养与分离。该技术的应用前景包括对放射治疗引起的口干症（即干口症）的治疗。唾液腺干细胞可用于治疗头颈部癌症患者因放疗等原因导致的口干症（Xerostomia）。在开始本实验前，需准备好缓冲液、小鼠、唾液腺组织培养物、培养基以及酶溶液。根据随附的书面实验方案，所有解剖和组织培养步骤均应在无菌的组织培养超净台内进行。分离并解剖小鼠唾液腺后，用天平称量唾液腺组织并记录重量。使用刮勺将唾液腺转移至小型培养皿中，用弯头解剖剪将唾液腺剪切成均匀的浆状物。剪去P 1000移液器吸头的末端，以形成更宽的开口。 每80毫克组织用移液器向培养皿中加入1毫升缓冲液，并将匀浆转移至15毫升离心管中。再取一份每80毫克组织1毫升缓冲液加入培养皿中，以收集任何残留的小块组织，然后将此溶液一并加入离心管。然后迅速加入 250 µL 氯化钙溶液、25 µL 透明质酸酶溶液和 25 µL 胶原酶溶液，每 80 mg 组织加入两种酶溶液。将含有组织和酶混合液的试管置于 37 °C 摇动水浴中，孵育 20 分钟。孵育结束后，取出试管。如前所述，使用切去末端的 P 1000 吸头将组织与酶溶液充分混匀，约 10 次。将试管放回 37 °C 水浴中继续孵育 20 分钟。第二次孵育结束后，将样品在400 × g 条件下离心8分钟，离心后弃去上清液，并用每80毫克起始组织加入2毫升缓冲液，小心重悬沉淀。然后每80毫克组织加入250微升氯化钙溶液、25微升透明质酸酶溶液和25微升胶原酶溶液，即两种酶溶液。将离心管放回37摄氏度摇动水浴中孵育20分钟。从水浴中取出组织，按前述孵育步骤重复操作。以400 × g离心样品8分钟。再重复一次，然后弃去上清液。组织现在已准备好进行洗涤，以在前一次离心后为过滤做准备。将两毫升缓冲液用移液管加入管中，并充分吹打混匀。重悬沉淀后，将悬液继续悬浮。在400 ×g 条件下离心样品8分钟。然后弃去上清液，用移液器吸除。每80毫克组织加入1毫升缓冲液至试管中，再次进行吹打重悬沉淀。重复离心步骤。在400 × g条件下离心8分钟。离心期间，准备过滤步骤：将一个孔径为100微米的滤器置于一个50毫升离心管上。离心结束后，弃去上清液，并向管中加入每80毫克组织1毫升缓冲液。使用剪去末端的P1000枪头，上下吹打，确保沉淀充分重悬。然后将匀浆液转移至孔径为100微米的滤膜，并使其自然渗滤进入50毫升离心管中。注意匀浆液体积不得超过3毫升，否则滤膜可能堵塞。若超过此体积，应使用P1000移液器将滤膜下方积聚的组织取出，并转移至含有滤液的50毫升离心管中。使用带有26号针头的1毫升注射器，从50毫升离心管中吸取匀浆液，并将其转移至装有50微米孔径滤膜帽的5毫升管上。让匀浆液自然渗过滤膜。若过滤速度较慢，可适当松开滤膜帽，避免过紧。当所有匀浆完全通过滤膜进入离心管后，封口可防止过滤过程受到影响。将样品在400 × g 条件下离心8分钟。离心结束后，沉淀的细胞即可用于接种培养板。将唾液腺细胞重新悬浮于每80毫克组织1毫升MSG培养基中开始实验。按照标准操作规程对细胞进行计数。此处使用自动细胞计数仪测定细胞数量。计算含有 0.4 × 10⁶ 个细胞所需的细胞悬液体积，并据此确定可接种的孔数。向12孔培养板的每孔中加入1 mL MSG培养基。确保细胞悬液充分混匀，并将含有0.4 × 10⁶ 个细胞所需体积的细胞悬液加入各孔中。将培养板转移至含有5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。培养两天后，观察培养物中是否存在SLOs类球体，并确认其中无ace细胞。这是小鼠唾液腺组织的一个示例，按照所述方法处理，并通过相差显微镜在培养第0至10天期间进行观察，其中细胞的小聚集体即为SLOs类球体，其体积在此期间逐渐增大。图中显示的是代表性 SLOs 类球体培养 3 至 5 天后对干细胞标志物蛋白 C kit 的免疫染色结果。通过流式细胞术分析，c-Kit 的表达证实了在培养 3 至 5 天的 SLOs 类球体中存在假定的干细胞。这些 SLOs 类球体还可进一步分化，形成腺泡和导管样结构，其形态与天然唾液腺中的结构相似。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠唾液腺中分离唾液腺及干细胞。

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