在油脂介孔膜蛋白的结晶
March 28th, 2011
协议描述获得一个膜蛋白，重组蛋白在油脂立方米阶段（LCP）起的晶体衍射的质量必不可少的步骤，寻找LCP - FRAP预结晶实验的初始条件，设立LCP的结晶试验和收获晶体。
以下程序的总体目标是获得膜蛋白的高质量晶体，用于通过 X 射线晶体学进行结构化测定。这是通过将蛋白质重构到脂质立方相膜中并与沉淀剂溶液孵育来实现的，由于结晶空间的大小和结晶实验的反馈有限，沉淀溶液会诱导晶体成核和生长。开发了 PHOTOBLEACHING 或 LCP Frap Prec 结晶测定后的脂质立方相荧光恢复，以选择最有希望的结晶条件。
该分析减少了筛选量并增加了获得初始结晶命中的机会。一旦找到初始命中，就会进行优化试验，以改善晶体生长。最后，收获优化的晶体并在液氮中冷冻，以便在同步加速器源处收集数据。
结果表明，LCP FRA 测定法在 LCP 中有效获得 BE 两个肾上腺素能受体的初始晶体，其中进一步优化导致晶体衍射质量。该技术利用了重复立方相提供的类似天然的膜环境，与结晶和洗涤剂溶液相比，通常会产生溶解含量低且有序性更好的晶体。通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为脂质质量相的高粘度使这种材料难以处理。
然而，当使用正确的工具并掌握技术时，该程序并不比任何其他蛋白质结晶技术更困难，并且适合自动化和高通量。那么让我们开始吧。在去污剂溶液中纯化目标膜蛋白，并将蛋白质去污剂复合物浓缩至约 10 至 20 毫克/毫升。
将约 25 毫克 A LCP 宿主脂质或脂质混合物转移到塑料管中，并在 40 摄氏度下孵育几分钟，直到脂质融化。接下来，将注射器耦合器连接到 100 μL 气密注射器上。使用可调体积移液器将熔融脂质装入注射器。
记录注射器中脂质的体积，再向 100 微升注射器中加入足够的蛋白质溶液，以得到蛋白质溶液与脂质的体积比为 2 比 3。通过注射器耦合器将两个注射器连接在一起。交替推动注射器柱塞，使脂质和蛋白质通过耦合器的内针来回移动，直到脂质中观相变得均匀。
LCP 在机械混合时自发形成，蛋白质在 LCP 的脂质双层中重构。LCP 的形成可以通过其透明和凝胶状的稠度来验证，并且在显微镜下观察时没有双折射，配备交叉偏振器，或者如果可能的话，通过使用小角 X 射线衍射。要开始 LCP frap 测定，请按照书面方案中的说明，用荧光饮食以约 100 比 1 的蛋白质与死亡比标记蛋白质。
去除未反应性染料，将蛋白质浓缩至约 1 毫克/毫升。接下来，按照与未标记蛋白质相同的方式在 LCP 中重构标记的蛋白质。设置检测板。
使用 LCP 包膜筛查解决方案。首先将富含蛋白质的 LCP 转移到连接到重复注射器分配器的 10 μL 气密注射器中，然后将一个可拆卸的短针头连接到 10 μL 注射器上。在四个相邻孔的表面分配 200 纳升 LCP 推注，每个 LCP 推注与 1 微升相应的 LCP FRA 筛选溶液形成一个 2 x 2 的方形覆盖层。
分配筛选溶液后，用 18 毫米见方的玻璃盖玻片盖住四个加载的孔。轻轻按压盖玻片以密封孔。对下一组四个孔重复此过程，直到填充整个板。
装满后，用箔纸盖住板。将板在 20 摄氏度下孵育至少 12 小时。为了达到平衡状态，将其中一个板放在 LCP Frap 站上，并使用 10 倍物镜聚焦在第一口井上。
frap 数据采集是使用 image pro 脚本自动执行的，用户首先输入所有采集参数，然后按下启动按钮。典型的采集序列从记录 5 张预漂白图像开始，然后触发漂白激光，以最快的速率流式传输约 200 张图像的快速恢复序列，然后拍摄 50 张图像的缓慢恢复序列，图像之间的间隔为 1 到 20 秒，具体取决于蛋白质扩散速率。数据收集完成后，对漂白点内部的强度进行积分，对于放置在激光漂白区域外部的参考点，所有帧都正确。
在数据采集过程中由光线波动和漂白引起的偏差的积分强度曲线对校正后的强度进行归一化，使预漂白强度等于 1，初始漂白强度等于零，拟合书面协议中描述的归一化强度与时间的曲线，以获得流动分数和扩散系数。对下一个重复此过程，很好地比较在不同筛选条件下获得的移动级分和扩散系数。根据促进蛋白质扩散的成分设计 nu 结晶筛选，并排除未观察到蛋白质扩散的条件，以建立 LCP 结晶试验。
像以前一样在 LCP 中重构蛋白质，然后像 LCP frap 一样设置结晶板，但使用结晶筛选解决方案。或者，一旦制备了结晶板，就可以自动设置结晶试验，将它们在恒温下孵育，定期检查晶体的形成和生长。一旦蛋白质晶体生长，将装有晶体的板放在配备线性旋转偏振器和分析仪的具有可变变焦的立体显微镜下。
使用低倍变焦聚焦感兴趣的孔，以便将整个孔置于视野内。在盖玻片上划线四次，使用陶瓷毛细管切割石的尖角在孔边界内形成一个正方形。用结实的尖头镊子按压刻痕周边，使划痕沿着盖子的厚度传播。
滑玻璃在刻痕正方形的对角上打两个小孔。通过其中一个孔注入几微升沉淀剂溶液，以减少后续步骤中的脱水。使用倾斜的锋利针形探针，沿一侧或两侧打碎玻璃杯，以释放切口方块。
小心地提起玻璃方块，观察立方相推注。如有必要，在孔中暴露的立方相推注顶部添加额外的几微升沉淀剂溶液，补充冷冻保护剂，增加显微镜的放大倍数并聚焦在晶体上。调整偏振片和分析仪之间的角度，以增加 frt 晶体与背景之间的对比度，同时保持足够的光线来查看采集回路。
然后去除多余的脂质，直接从 LCP 中收获晶体，将其舀入一个强大的 gen 微型支架中，该支架的直径与晶体尺寸闪存相匹配。将微米镶座与收获的晶体一起在液氮中冷冻，并将其运送到同步加速器源光束线进行 X 射线数据收集工程化的 β 2 肾上腺素能受体用 S SI 三 NHS 酯标记，并在自动高通量模式下用于 LCP Frep prec 结晶测定，其中 96 孔板的每个样品依次漂白，并在孵育 30 分钟后测量荧光回收率。绘制了所有 96 个样品获得的荧光回收率，代表每个样品中的移动度分数。
筛选溶液含有 0.1 摩尔 tris pH 值 8 30% 体积比 PEG 400，以及两种不同浓度的 48 种不同盐。显示了几种代表性条件的荧光回收曲线。实线曲线表示归一化强度与时间的拟合，在含有氯化钠的样品中，由于荧光标记的脂质，回收率低于 10%。
与蛋白质共纯化的 β 2 肾上腺素能受体与 olol 复合物中的蛋白质初始晶体命中是通过粗网格筛选围绕含有硫酸钠和甲酸钠的 LCP Frap 鉴定的最有希望的条件获得的。进一步优化沉淀条件可产生衍射质量的晶体。在这里，在硫酸钠和甲酸钾存在下生长的晶体图像是在明场模式下拍摄的。
也可以使用交叉偏振器观察相同的晶体。一旦掌握了脂质立方相中的重构蛋白，即可在 10 至 15 分钟内共同完成，在 1 小时内手动设置 96 孔结晶板在高模式下的 L 3 B 包裹分析需要每个 96 孔板约 2 小时，而 H 晶体每孔大约需要 10 至 20 分钟。本视频中所示的程序为进行音乐结晶试验提供了基本指南。
然而，与任何结晶实验一样，需要进行广泛的筛选和优化，并且不一定能保证成功的结果。
概览
本文概述了使用脂质立方相（LCP）获得高质量膜蛋白晶体的程序。该方法包括蛋白质重组、结晶试验以及用于X射线晶体学的晶体收集。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 膜蛋白结晶
背景
- 膜蛋白对各种生物功能至关重要。
- 获得高质量晶体对于结构测定至关重要。
- 脂质立方相为结晶提供了类似原生环境。
- 传统方法常因蛋白质溶解度和结晶条件而面临挑战。
研究目的
- 开发可靠的膜蛋白结晶方法。
- 优化获得衍射质量晶体的条件。
- 利用LCP以获得更好的结晶结果。
使用的方法
- 在LCP中重组膜蛋白。
- 使用LCP-FRAP预结晶测定以确定最佳条件。
- 根据初步筛选结果设置结晶试验。
- 收集和冷冻优化后的晶体以便数据收集。
主要结果
- 在LCP中成功结晶β2-肾上腺素受体。
- 证明了LCP-FRAP在减少筛选时间方面的有效性。
- 获得适合X射线分析的衍射质量晶体。
- 突出了使用LCP相对于传统方法的优势。
结论
- LCP方法是膜蛋白结晶的可行方法。
- 适当的技术和工具可以简化这一过程。
- 该方法适用于自动化和高通量应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Membrane protein crystallization remains a bottleneck in structure-based drug discovery, particularly for GPCRs and transporters. The lipidic cubic phase (LCP) method provides a native-like membrane environment that improves crystal quality and reduces screening burden. This approach supports target de-risking by enabling structural insights critical for lead optimization and mechanistic validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural determination of membrane proteins in a lipid environment that mimics native bilayers.
- Operational Value: Reduces false negatives in target validation by improving crystallization success rates.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing through high-resolution structural data for binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: LCP-FRAP assay quantifies protein diffusion and mobility to prioritize crystallization conditions.
- Operational Value: Streamlines screening by identifying promising hits before extensive trial setup.
- Assay Readiness: Generates quantitative mobile fraction and diffusion coefficient outputs for condition ranking.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides structural data to guide mutagenesis and functional studies in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies ligand-binding modes and conformational states for lead optimization.
- Preclinical Model Alignment: Enables structure-guided design of compounds with improved target selectivity.
Pipeline & Workflow Integration
The LCP method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical candidate optimization.
- Discovery Biology: Supports target validation by enabling 3D structure determination of membrane proteins.
- Screening: LCP-FRAP assay provides diffusion-based readouts to triage crystallization conditions.
- Analytics: Mobile fraction and diffusion coefficient measurements enable quantitative comparison of LCP formulations.
- Translational Research: Structural outputs inform SAR studies and lead optimization campaigns.
- Enterprise Reuse: Standardized LCP preparation and dispensing enable reuse across multiple membrane protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-quality crystals enable accurate structure determination for structure-based drug design.
- Operational Value: Syringe mixer and nanoliter dispensing improve reproducibility and reduce sample consumption.
- Strategic Value: Reduced screening time and increased hit rates improve capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid phase behavior and viscous material handling is required.
- Instrumentation includes syringe mixers, repetitive dispensers, and fluorescence recovery assay platforms.
- Standardization across teams requires consistent LCP preparation and protein-to-lipid ratios.
- Adaptation to different membrane proteins may require lipid composition optimization.
- Practical limitations include the need for extensive screening despite improved hit rates from LCP-FRAP.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Introduction
2:09
Protein Reconstitution in LCP (Lipid Cubic Phase)
3:42
Lipid Cubic Phase - Fluorescence Recovery After Photobleaching (LCP-FRAP) Pre-Crystallization Assay
6:55
Preparation and Harvest of LCP Crystals
9:25
Representative Results: Crystallization of Human Beta 2 Adrenergic G Protein-Coupled Receptor
11:06
Conclusion
