Name: 在油脂介孔膜蛋白的结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习利用脂质立方相（LCP）技术进行膜蛋白结晶的方法，通过LCP-FRAP预结晶筛选优化条件，获得适用于X射线衍射分析的高质量晶体。该技术为结构生物学研究提供了可靠的实验方案。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 GM073197 和 RR025336。

图11,2展示了一项in meso结晶实验的典型流程。预结晶LCP-FRAP实验为可选步骤；然而，该步骤可显著加快初始结晶条件的筛选过程，尤其适用于难以结晶的膜蛋白3。
1. 蛋白质在LCP中的重构
<ol>
<li>在去垢剂溶液中纯化目标膜蛋白，并将蛋白/去垢剂复合物浓缩至约 10 - 20 mg/mL，注意避免过度浓缩去垢剂1,4。</li>
<li>将约 25 mg 的 LCP 宿主脂质（通常为单油精）或脂质混合物转移至 1.5 mL 塑料离心管中，在 40 °C 下孵育数分钟，直至脂质熔化。</li>
<li>将一个连接器接头安装到一支 100 μL 耐压气密性注射器上。</li>
<li>使用可调移液器将熔融脂质吸入注射器中。记录注射器中脂质的体积。</li>
<li>用蛋白溶液以 2/3（v/v）的体积比装填另一支 100 μL 注射器。</li>
<li>通过连接器接头将两支注射器连接在一起。</li>
<li>交替推动注射器推杆，使脂质和蛋白在接头内针中来回移动，直至脂质介相变得均匀。LCP 在机械混合过程中自发形成，蛋白则被重组至 LCP 的脂双层中。可通过其透明且呈凝胶状的性状，以及在配备交叉偏振器的显微镜下观察无双折射现象来验证 LCP 的形成；如条件允许，也可通过小角 X 射线衍射进行验证1。</li>
</ol>
2. LCP-FRAP 预结晶实验
LCP-FRAP 实验旨在测量膜蛋白在不同筛选条件下于 LCP 中重组后的扩散特性3。膜蛋白在 LCP 中的长距离扩散对于成功结晶至关重要；然而，LCP 的微观结构会限制大分子蛋白或寡聚蛋白聚集体的扩散。in meso 结晶实验失败的常见原因之一是蛋白快速聚集，导致扩散能力丧失。已有研究表明，蛋白的聚集行为取决于特定的蛋白构建体、宿主脂质以及筛选溶液的组成3。
<ol>
<li>以荧光染料（Cy3 或类似物）标记蛋白质，蛋白质与染料的比例约为 100:1，去除未反应的染料后将蛋白质浓缩至约 1 mg/mL。可选择标记游离胺基或游离巯基。当标记游离胺基时，使用 pH 7–7.5 的条件以优先标记蛋白质的游离 N 末端。需注意，胺基标记也可能标记与蛋白质共纯化的脂质。2,3.</li>
<li>按照第1)节所述，将标记的蛋白质在LCP中重悬。</li>
<li>按照第3)节所述设置检测板，但使用LCP-FRAP筛选溶液代替结晶筛选溶液2.</li>
<li>将培养板置于培养箱中孵育 20 °C 在黑暗中静置至少12小时，以达到平衡状态。</li>
<li>将其中一块培养板置于LCP-FRAP工作站上，使用10x物镜对准第一个孔并调焦。</li>
<li>获取5张荧光图像以记录初始的漂白前状态。</li>
<li>触发激光。应调整激光功率和脉冲次数，使标记的蛋白质在漂白区域中心被漂白约30%–70%。</li>
<li>激光激发后立即开始以最快速度连续采集约200帧的快速漂白后图像序列。</li>
<li>随后记录约50张慢速漂白后图像序列，根据蛋白质的扩散速率选择每帧图像之间的时间间隔为1-20秒。</li>
<li>在所有帧中积分漂白区域内的强度，并通过将漂白区域内的强度除以激光漂白区域外参考区域的平均强度，校正采集过程中发生的漂白效应和光照强度波动。</li>
<li>将校正后的强度进行归一化处理，使漂白前的强度等于1，初始漂白时的强度等于0。</li>
<li>拟合归一化强度随时间变化的曲线， F(t)，使用以下公式5: 
	F(t) = M × exp(-2T/t) x (I0(2T/t) + I1(2T/t)), (公式1) 
其中，M 为扩散分子的移动比例，T 为特征扩散时间， t 是每个记录帧的实际时间，I0 我1 是 0th 和 1st 修正贝塞尔函数的阶数</li>
<li>根据以下公式计算扩散系数 D： 
	D = R2/4T, (Eq.2) 
其中 R 为漂白区域的半径。</li>
<li>移至下一个孔，重复步骤 2.5) - 2.13)。</li>
<li>比较不同筛选条件下获得的移动组分比例和扩散系数。根据促进蛋白质扩散的组分设计新的结晶筛选条件，并排除未观察到蛋白质扩散的条件。如果蛋白质在所有筛选条件下均未发生扩散，可考虑扩大筛选范围或尝试新的蛋白质构建体。</li>
</ol>
3. 设置LCP结晶实验
<ol>
<li>按照第1节所述方法在LCP中重悬蛋白质。</li>
<li>将含有蛋白质的LCP转移至连接在重复性注射器分配器上的10 μL气密注射器中。</li>
<li>在10 μL注射器上安装一根短的可拆卸针头（规格26，长度10 mm）。</li>
<li>在四个相邻孔的表面分别分配200 nL的LCP液滴，形成2×2方阵。</li>
<li>在每个LCP液滴上覆盖1 μL相应的结晶筛选溶液。</li>
<li>用一块18 mm的方形玻璃盖玻片封盖四个已加样孔。轻轻按压盖玻片以密封各孔。</li>
<li>对下一组四个孔重复步骤3.4)–3.6)，直至整块板全部加样完毕。</li>
<li>将该板在恒定温度下孵育，并定期检查晶体形成与生长情况。</li>
</ol>
4. 从LCP中收获晶体
<ol>
<li>将装有蛋白质晶体的晶体板置于配备可变变焦功能的体视显微镜下，显微镜需配置线性旋转偏振器和分析器。</li>
<li>使用低倍变焦聚焦于目标孔，使整个孔位于视野范围内。</li>
<li>使用陶瓷毛细管切割石的锋利边缘，在盖玻片玻璃上沿孔壁内侧划四道，形成一个方形刻痕。</li>
<li>使用尖锐的镊子在划痕边缘施加压力，使划痕穿透盖玻片玻璃的整个厚度。</li>
<li>在已划线的正方形对角处打两个小孔。</li>
<li>注射少量 μL 通过其中一个孔加入沉淀剂溶液，以减少后续步骤中的脱水现象。</li>
<li>使用带角度的锐利针头探针，沿一侧或两侧划破玻璃，以分离出切割出的方形区域。</li>
<li>小心抬起玻璃方片，观察立方相团块。如果团块粘附在盖玻片上，则将玻璃方片翻转并置于孔的底部。</li>
<li>多加几毫升 μL 沉淀剂溶液，并根据需要在孔中暴露的立方相团块上方添加防冻剂。</li>
<li>增加显微镜的放大倍数，并聚焦于晶体。</li>
<li>调节偏振器与分析器之间的角度，以增强双折射晶体与背景之间的对比度，同时保留足够的光线以便观察 harvesting loop。</li>
<li>选择与晶体尺寸相匹配直径的 MiTeGen MicroMount，然后通过将晶体直接舀入 MicroMount 的方式从 LCP 中收获晶体。</li>
<li>将收获的晶体连同MicroMount一起在液氮中进行闪冻，并送往同步辐射光源线站进行X射线数据收集6.</li>
</ol>
5. 代表性结果：
在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中表达了一种经基因改造的人源β2肾上腺素能G蛋白偶联受体（β2AR-T4L），并在十二烷基麦芽糖苷（DDM）/胆固醇半琥珀酸酯（CHS）去垢剂溶液中纯化，该受体与部分逆向激动剂卡拉唑洛尔结合7。将该蛋白用Cy3 NHS酯标记后，用于LCP-FRAP结晶前检测（图2）。基于LCP-FRAP检测结果所选定的多个条件进行粗筛网格实验，获得了初步的类晶体信号（图3）。进一步优化沉淀剂条件后，得到了可用于衍射的高质量晶体（图4）。
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="蛋白质结晶过程示意图；包括LCP重构、结晶试验、X射线分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 典型LCP结晶实验的流程图。灰色框中的步骤在本实验方案中未作描述。
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="移动分数分析、荧光恢复曲线、钠化合物、色谱分离、动力学" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 基于单油酸甘油酯LCP中β2AR-T4L/卡拉唑ol的LCP-FRAP实验。A) 以自动高通量模式进行的LCP-FRAP实验结果，其中96孔板中的每个样品依次进行漂白，并在30分钟孵育后测量荧光恢复。所获得的荧光恢复值代表各样品中的移动分数，并对全部96个样品作图显示。筛选溶液包含0.1 M Tris（pH 8）、30 % v/v PEG 400，并联合48种不同盐类在两种不同浓度下的组合。B) 若干代表性条件下的荧光恢复曲线。实线曲线为使用公式1拟合的结果。移动分数和扩散系数通过公式1和公式2确定。含氯化钠样品中低于10%的快速恢复，是由于与蛋白共纯化的荧光标记脂质所致。
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="荧光显微镜图像，脱落细胞分析，显示细胞形态，比例尺为100 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 通过围绕LCP-FRAP鉴定出的最有希望条件进行粗略网格筛选获得的β2AR-T4L/卡维地洛初始晶体（含硫酸钠（A图）和甲酸钠（B图））。蛋白质用Cy3 NHS酯标记，荧光图像使用543 nm激发光和605 nm发射光采集。 
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="结晶过程显微镜图像；阶段A-D；光学显微镜；比例尺100 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. β2AR-T4L/卡维地洛优化后的晶体。在硫酸钠（图A和B）和甲酸钾（图C和D）存在下生长的晶体图像，分别在明场模式（图A和C）和交叉偏振光下（图B和D）拍摄。

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本实验方案为进行in meso结晶实验的主要步骤提供了基本的可视化指导。有关这些实验方案的更深入细节，包括可能存在的陷阱、局限性或替代方法，可参见其他文献1,2。在早期阶段，可选择性地采用LCP-FRAP实验，以帮助筛选最具前景的蛋白质构建体、LCP宿主脂质和脂质添加剂，并缩小可能的沉淀剂和缓冲条件的范围3。一旦获得初步的结晶结果，应进一步优化以获得质量更高的晶体。对in meso结晶条件的优化，基本类似于可溶性蛋白质结晶条件的优化，但需额外考虑与LCP组成相关的参数1。在脂质介相中生长的膜蛋白晶体通常比在去垢剂溶液中获得的晶体更小，但结构更为有序，因此能显著受益于现代同步辐射光源配备的微聚焦光束线6。
与原位结晶相关的许多步骤，包括设置结晶或检测板、进行LCP-FRAP检测以及晶体观察，已实现半自动或全自动1,2,8,9，可在消耗少量蛋白质和脂质的情况下筛选大量条件。然而，蛋白质在LCP中的重组以及晶体 harvesting 仍为手动操作，较为繁琐，因此亟需改进。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L 气密性注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>需要 2 支注射器</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 气密性注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>注射器连接头</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>连接头可使用现有部件自制，具体方法见参考文献 10</td></tr><tr><td>重复式注射器分配器</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>可通过改装重复式注射器分配器，使分配体积减少约 3 倍&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>短型（0.375&amp;#8221;）平头可拆卸针头（3 型针尖，26 号规格）</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96 孔玻璃三明治板</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>对于手动操作，使用标准显微镜载玻片和带有打孔的双面胶带组装玻璃三明治板更为方便&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>单油精（monoolein）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>结晶筛选试剂盒</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>大多数市售的结晶筛选试剂盒均可用于初步筛选。对于持续破坏脂立方相（LCP）的条件，可将其稀释 2 倍以提高兼容性&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>毛细管切割石</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头镊子</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>带角度的尖锐探针</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>选择与晶体尺寸匹配的 MicroMount 直径</td></tr></tbody></table>

膜蛋白在脂质介相中的结晶

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

膜蛋白在活细胞中执行与信号转导、物质运输和能量转换相关的关键功能，因此与多种功能障碍和疾病密切相关。然而，相较于可溶性蛋白，人们对膜蛋白在结构与功能方面的理解仍严重滞后，这主要归因于其在增溶以及获得可用于衍射分析的高质量晶体方面存在诸多困难。in meso 结晶法（也称为介晶相结晶或LCP结晶）是一种极具前景的技术，已成功应用于获得微生物视紫红质、光合作用蛋白、外膜β桶蛋白以及G蛋白偶联受体的高分辨率结构。该方法利用了类似天然的膜环境，通常与传统去污剂溶液结晶相比，所获得的晶体溶剂含量更低、有序性更好。该技术本身并不复杂，但需要掌握脂质相行为的相关知识，并具备操作黏稠介晶相材料的经验。本文演示了一种使用注射器混合器制备LCP并将在脂质双分子层中重建膜蛋白的简单高效方法，随后将纳米量级的LCP样品分配至检测板或结晶板中，开展结晶前检测，并从LCP基质中收获晶体。这些方案为开展in meso结晶实验提供了基本指导；然而，与所有结晶实验一样，仍需进行广泛的条件筛选和优化，且不能保证一定获得成功结果。

本方案描述了从膜蛋白在立方相脂质中的重组开始，获得可用于衍射分析的晶体所需的关键步骤，包括利用LCP-FRAP预结晶实验筛选初始条件、设置LCP结晶试验以及晶体的收获。

膜蛋白在活细胞中执行与信号转导、物质运输和能量转换相关的关键功能，因此是……

以下实验的总体目标是获得高质量的膜蛋白晶体，用于X射线晶体学结构解析。该目标通过将蛋白质重组至脂质立方相膜中，并与沉淀剂溶液共同孵育来实现；由于结晶空间广阔且结晶实验的反馈有限，可诱导晶体成核与生长。脂质立方相光漂白后荧光恢复（LCP Frap Prec）结晶实验被开发用于筛选最具前景的结晶条件。该实验方法可减少筛选工作量，并提高获得初始结晶的几率。一旦发现初始结晶，即开展优化实验以改善晶体生长。最后，将优化后的晶体收获并置于液氮中冷冻，用于在同步辐射光源处进行数据收集。结果表明，LCP FRA 分析法可有效用于在脂立方相（LCP）中获得 β2 肾上腺素受体的初始晶体，经进一步优化后得到了可用于衍射的高质量晶体。该技术利用了重复立方相所提供的类天然膜环境，通常相较于在去垢剂溶液中结晶，所获得的晶体溶剂含量较低、有序性更佳。通常，初次接触该方法的研究者会因脂质中间相具有高黏度及类似凝胶的流变特性而难以操作该材料。然而，当使用合适的工具并掌握技术后，该方法的难度并不高于其他任何蛋白质结晶技术，并且适用于自动化和高通量操作。现在让我们开始。在去污剂溶液中纯化目标膜蛋白，并将蛋白-去污剂复合物浓缩至大约 10 至 20 毫克/毫升。取约25毫克A型LCP宿主脂质或脂质混合物，转移至塑料管中，在40摄氏度下孵育数分钟，直至脂质熔化。接着，将一个注射器连接器安装到100微升气密注射器上。使用可调体积移液器将熔化的脂质吸入注射器中。记录注射器中脂质的体积，另取一支100微升注射器，加入足量的蛋白质溶液，使蛋白质溶液与脂质的体积比为2:3。通过注射器连接器将两支注射器连接在一起。交替推动两支注射器的活塞，使脂质和蛋白质溶液反复通过连接器内部的针管，直至脂质中间相变为均一状态。在机械混合后，LCP 会自发形成，蛋白质则被重组到 LCP 的脂质双分子层中。可通过其透明且呈凝胶状的性状，以及在配备交叉偏振器的显微镜下观察时无双折射现象来验证 LCP 的形成；若条件允许，也可通过小角 X 射线衍射进行确认。开始进行 LCP 荧光漂白恢复（FRAP）实验前，需按照书面实验方案中的描述，以约 100:1 的蛋白质与染料比例，用荧光染料标记蛋白质。除去未反应的染料，并将蛋白质浓缩至大约每毫升一毫克。接着，以与未标记蛋白质相同的方法，在LCP中重组标记的蛋白质。设置检测板。使用LCP包埋筛选溶液。首先将含有蛋白质的LCP转移至一支10微升气密型注射器中，该注射器连接于重复式注射分配器，然后在10微升注射器上安装一根短的可拆卸针头。将200纳升的LCP液滴分配至四个相邻孔的表面，形成2×2排列的方阵，每个LCP液滴上覆盖1微升相应的LCP FRA筛选溶液。加入筛选溶液后，用18毫米见方的玻璃盖玻片封合已加样的四个孔。轻轻按压盖玻片以密封各孔。重复此步骤，依次处理接下来的四孔，直至整块板的所有孔均被加样并封合。填充后，用铝箔覆盖板。在 20 摄氏度下孵育平板至少 12 小时。为达到平衡状态，将其中一块平板置于 LCP Frap 站上，使用 10 倍物镜聚焦于第一个孔。使用图像处理脚本自动进行FRAP数据采集，用户首先输入所有采集参数，然后按下开始按钮。典型的采集序列开始于记录五幅预漂白图像，接着触发漂白激光，并同步开始以尽可能快的速度连续采集约200幅快速恢复图像，随后采集50幅慢速恢复图像，图像之间的时间间隔根据蛋白质扩散速率设定为1至20秒。数据采集完成后，需在所有帧中对漂白区域内的强度以及位于激光漂白区域外的参考区域的强度进行积分校正。通过数据采集过程中由光照波动和漂白引起的偏差所得到的积分强度曲线，对校正后的强度进行归一化处理，使漂白前的强度等于1，初始漂白后的强度等于0，然后按照书面实验方案中所述，拟合归一化强度随时间变化的曲线，以获得可移动组分比例和扩散系数。对下一个样品重复此操作，并比较不同筛选条件下获得的可移动组分比例和扩散系数。根据促进蛋白质扩散的组分设计新的结晶筛选条件，排除未观察到蛋白质扩散的条件，进而开展LCP结晶实验。按照 LCP 的方法重新溶解蛋白质，然后设置结晶板，方法与 LCP frap 相同，但使用结晶筛选溶液。或者，在结晶板制备完成后，可通过机器人系统设置结晶实验，于恒定温度下孵育，并定期检查晶体的形成与生长情况。待蛋白质晶体生长完成后，将含有晶体的培养板置于配备可变变焦功能的体视显微镜下，并装配线性旋转偏振器和分析器进行观察。使用低倍变焦聚焦于目标孔，使整个孔位于视野范围内。用陶瓷毛细管切割石的尖角在盖玻片玻璃上沿孔的边界划四道，形成一个正方形刻痕。用尖锐有力的镊子在刻痕周围施压，使划痕穿透盖玻片的整个厚度。在划线形成的方形对角处，用玻璃穿孔器打两个小孔。通过其中一个孔注入几微升沉淀剂溶液，以减少后续步骤中的脱水现象。使用带角度的尖锐针头探针，沿一侧或两侧划破玻璃，使方形切片松动脱落。小心抬起玻璃方片，观察立方相胶状物。如有必要，在孔中暴露的立方相胶状物上方额外添加几微升含有 cryoprotectant 的沉淀剂溶液，增加显微镜的放大倍数并聚焦于晶体。调整偏振器与分析器之间的角度，以增强晶体与背景之间的对比度，同时保持足够的光线以便观察收获环。然后去除多余的脂质，直接从LCP中用微型工具刮取晶体，并将其装载到已选好的mighty gen微晶载具上，该载具的直径需与晶体尺寸相匹配。将载有晶体的微晶载具在液氮中迅速冷冻，并送往同步辐射光源线站进行X射线数据收集。工程化的β2肾上腺素能受体用S SI 3 NHS酯标记后，用于LCP Frep预结晶分析，在自动高通量模式下进行，其中96孔板中的每个样品依次被漂白，并在30分钟孵育后测量荧光恢复情况。所获得的荧光恢复值代表每个样品中的可移动组分，对全部96个样品的荧光恢复结果进行绘图分析。筛选溶液包含 0.1 摩尔 Tris（pH 8）、30%（体积比）PEG 400，并与 48 种不同盐类在两种不同浓度下组合。图中显示了若干代表性条件下的荧光恢复曲线。实线曲线代表归一化强度随时间变化的拟合结果；样品中加入氯化钠时快速恢复幅度小于 10%，这是由于含有荧光标记的脂质所致。通过在LCP FRAP鉴定出的最适条件（含硫酸钠和甲酸钠）附近进行粗略网格筛选，获得了β2肾上腺素受体与奥洛尔（olol）复合物的初始晶体衍射结果，并与蛋白共纯化。进一步优化沉淀剂条件后，获得了可用于衍射的高质量晶体。此处展示的是在硫酸钠和甲酸钾存在下生长的晶体在明场模式下的图像。相同的晶体也可以使用交叉偏振器进行观察。一旦掌握，蛋白质在脂质立方相中的重组可在10至15分钟内完成，手动设置一块96孔结晶板可在一小时内完成。L three B包裹实验在高通量模式下每块96孔板约需两个小时，而H型晶体每孔大约需要10到20分钟。本视频中展示的步骤为进行膜蛋白结晶实验提供了基本指导。然而，与任何结晶实验一样，需要进行广泛的筛选和优化，且结果的成功并非必然可得。

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