Name: 机械操纵控制神经元轴突的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学习使用校准玻璃针在微达因范围内精确测量力以延伸轴突的方法。该技术可研究轴突起始与伸长动力学，为神经发育生物物理学提供可靠研究手段。

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我们衷心感谢 Robert E. Buxbaum 博士在本方法开发过程中所做出的重要贡献。

1. 制作玻璃针。
<ol>
	<li>使用可调节的微针拉制仪制备针尖呈锥形、长约 4 mm 的实心封闭梁结构微针。与长而柔韧的针尖相比，这种短至 4 mm 的长度可在实验过程中有效限制针尖的振动。在 4 mm 纤维的近端区域，针尖在 1 mm 范围内迅速从玻璃管的直径锥缩至 15 μm，而纤维最远端 1 mm 的直径为 2.5 μm。我们使用 R-6 玻璃毛细管（外径 0.9 mm，内径 0.6 mm，长度 8"）和 BB-CH 拉制仪。若研究者希望测量其他范围的力，则应拉制具有不同弹性性能（即不同长度或厚度）的微针。每根毛细管可拉制成四根 2" 长的微针。微针应存放于带盖的 160 mm 培养皿中，皿内放置两条造型粘土“蛇形支架”，将微针轻轻压入其中固定。</li>
	<li>玻璃微针以及下文将要描述的金属丝微针，本质上均为具有适当刚度的悬臂梁，用作测量所需力的弯曲弹簧。需注意的是，无论材料成分如何，梁的弯曲力与其长度的立方成正比。因此，在下述任何校准步骤中，若某根微针/梁的刚度不足，可通过略微缩短其长度来提高刚度（例如，缩短 10% 可使刚度增加 28%，即 0.93）。</li>
</ol>
2. 制作和校准金属丝针头
<ol>
	<li>通过将一根直径为0.001英寸的铬镍合金丝插入玻璃针（第1.1节制备）内部（针尖已折断）来制作一根金属校准针。将金属丝从针尖拉出至26 mm长度，并用强力胶固定。将远端1 mm的金属丝弯成钩状。</li>
	<li>使用1米长的直径为0.003英寸的康铜丝制作微小配重。为准确测量，将金属丝用胶带固定在米尺上，使其尽可能拉直。称量1米长的金属丝，精确切割成1 cm长的小段，并将其中若干段弯成V形。</li>
	<li>校准金属针需要配备带测微目镜的解剖显微镜和微操纵器。使用通用支架将显微镜侧向倾斜90°，以便观察金属针向下偏转的情况。将第2.1节制备的金属针安装在微操纵器的工具夹持器上，使钩状部分垂直于显微镜的光轴。将金属针的钩与目镜标线对齐。将1 cm长的微小配重悬挂在钩上，记录其偏转量。参考金属丝的弯曲常数（μdynes/μm）计算为微小配重（注意：1 mg = 0.98 dynes）除以观测到的偏转量（μm）所得的比值。为准备下一步操作，用手术刀在配重悬挂点处将钩切掉。钩的存在会增加额外重量，使金属丝轻微弯曲，从而影响加配重前金属丝在目镜标线中的初始位置。金属丝弹簧常数的测量基于在弯曲点（即未来金属丝的尖端）施加配重时金属丝的偏转量。切除钩后，金属丝的弹簧常数不会改变。</li>
</ol>
3. 校准中间玻璃针
<ol>
	<li>校准中间玻璃针需要使用带有目镜测微尺的倒置显微镜。在显微镜载物台的一侧，配备一个机械微操纵器，用于将第2节中的金属丝针固定在视野中心；在另一侧则配备一个三轴液压微操纵器（见设备表），用于移动待校准的中间玻璃针。通过微操纵器，将两根针以约45°角在10倍物镜视野下，共同移入盛有水的160 mm × 30 mm 培养皿中，并使其在视野中心接触。</li>
	<li>首先使用不同拉针仪参数制备一系列玻璃针，用于评估。目标是制备出弯曲弹性系数为20–30 μdynes/μm的中间玻璃针。刚度的测定通过测量中间玻璃针与金属丝针在受力时偏转量的比值来完成。例如，当金属丝针与玻璃针接触时，移动玻璃针使其推动金属丝针在目镜测微尺上偏转5个刻度。随后横向移动玻璃针使两针分离，金属丝针将恢复至初始位置，而玻璃针则停留在新的位置。玻璃针所受载荷可通过其新的零力位置与两针受力平衡时的位置之差计算得出（即两针接触时的位置）。在此例中，若两针均偏转至测微尺第5刻度（从零点起），金属丝针将回至零点，而玻璃针可能弹回至第25刻度；若如此，则表明在使金属丝针偏转5个刻度的相同力作用下，玻璃针偏转了20个刻度。因此，两针偏转量的比值即为玻璃针的校准依据，其刚度为金属丝针的¼。由于第3.4节中的弹簧常数计算依赖于距离比值，因此结果不受放大倍数或测微尺刻度大小的影响。唯一的限制条件是偏转量必须足够小，以确保处于针体的线性弹性范围内。</li>
	<li>在测微尺的5、10、15、3、7、12、17、5、10、15刻度位置依次进行一系列偏转测试。若任何一次偏转过早释放，则需重复该次测试。每次偏转之间，应保持金属丝针对准零点。对每一次偏转，记录其偏转量以及释放后玻璃针的最终零载荷位置，从而获得10组数据对。也可采用其他序列，但本序列设计目的在于早期评估数据的内部一致性、线性关系及滞后现象（例如：5 + 10 应约等于15；3 + 7 应约等于10；起始和末尾的5、10、15偏转结果应大致相同）。</li>
	<li>对第3.3节记录的偏转数据进行线性回归分析，可比单次偏转比值更精确地量化中间玻璃针的弯曲常数。同时，该分析还可评估针的线性程度及校准质量，表现为较高的相关系数（r值）以及回归线截距接近零。为准备第3.3节的10组数据对用于回归分析，需从每对数据中的第二个数值（即释放后玻璃针的最终零载荷位置）中减去对应的初始偏转量（即该对数据中的第一个数值）。完成此运算后，得到的新数据对由初始偏转量及其对应的差值构成。将5组（0,0）的控制数据对加入这10组实验数据对中，以确保线性回归在零偏转对应零力的条件下锚定。此步骤非绝对必要，但可提高准确性。在0,0点锚定的依据是：无外力作用时，针体不发生弯曲。基于这15组数据对进行线性回归计算，待校准玻璃针的弯曲弹簧常数等于已知金属丝针弯曲常数除以该回归线的斜率。</li>
</ol>
4. 用于操作神经元的工作玻璃针的校准
<ol>
	<li>用于神经元实验的玻璃针需具备足够的顺应性（2-15 μdynes/μm），其校准方法与第3节中所述的中间玻璃针校准方法类似。即，待选的工作针会偏转一根已知刚度的中间玻璃针，该中间针置于第3节中金属丝针所在的位置。刚度低于2 μdynes/μm的玻璃针可略微缩短，以使其刚度进入合适的范围。</li>
</ol>
5. 针头用粘附因子进行预处理
<ol>
	<li>将待处理的针头压入固定在夹具上的黏土块侧面，夹具位于含有10 ml黏附因子溶液的烧杯上方，使仅针尖浸入溶液中。避免浸湿毛细管针杆部分，因为这会随时间推移增加针尖包被物的积聚，从而改变针的刚度并降低其黏附效能。校准后的针头大约只能使用4次，且可重新校准以保证精度。针头需依次浸入0.1%多聚赖氨酸溶液中30分钟，随后浸入刀豆蛋白A（ConA，1 mg/ml，溶于PBS）中30分钟。多聚赖氨酸溶液可重复使用数周，并在-20°C下保存。ConA需每周新鲜配制，并在4°C下保存。对于其他细胞类型，针头表面呈现的分子可能影响实验的进行方向。</li>
</ol>
6. 仪器设备设置
<ol>
	<li>将牵引工作站设置在隔振台上。该工作站由一台倒置显微镜组成，显微镜载物台左上方装有一根横杆，横杆上安装有液压操纵器，该操纵器连接我们特制的平衡延伸装置，双工具夹持器插入其中。通过将一根针插入液压微操纵器的夹持器并使其进入显微镜的光路中，同时将操纵器的控制装置置于其调节范围的中心位置，来确定液压微操纵器在横杆上的位置。在对针进行黏附因子处理的同时，开启Ringcubator或其他显微镜载物台加热系统，以确保实验开始时载物台已达到热平衡状态。</li>
</ol>
7. 对齐针头
<ol>
	<li>目标是将两根针（参考针和工作针）在显微镜视野中调整至其尖端相距约 50 μm，且参考针位于培养皿上方，因此当牵引针在培养皿上聚焦时，参考针略为失焦。这两根针分别安装在针夹中，并插入徕卡双工具夹持器内，该夹持器本身是一个小型微操纵器。通过双工具夹持器的微操纵功能，使两根针尖保持平行对齐。将参考针仅插入针夹一小段距离，足以让紧固套环夹住针体，然后将此组件放入双工具夹持器的右侧。将处理过的工作针插入针夹约一半长度，并将其置于双工具夹持器的左侧。当两根针尖被调整至相同的前向位置并对齐时，由于针在各自夹持器中的长度不同，使得套环错开排列，从而不妨碍针尖彼此靠近。第 7.2 至 7.4 节操作无需放大观察；第 7.5 至 7.8 节需在显微镜下进行观察。</li>
	<li>预设液压微操纵器，使其垂直控制旋钮处于最高位置。将其他控制旋钮调至其调节范围的中心位置，包括工具夹持器的前后调节螺钉。</li>
	<li>使用工具夹持器右侧的左右调节螺钉，使两根针尖靠近。然后根据需要前后推动针夹本身，使两根针尖处于相同的前向位置。从侧面观察这对针，并使用右侧的上下调节螺钉将针尖调整至同一平面。若某根针在其针夹中倾斜，可通过旋转针夹来缩小间隙。</li>
	<li>摆动工具夹持器，将针尖置于培养皿液面之上的光路中，并使其以较陡角度向下倾斜。在移开手之前，先拧紧底部的球形接头螺钉。</li>
	<li>在将针过度下移之前，先在显微镜视野中找到针尖，以避免针尖断裂或与培养皿底部的碎屑发生缠绕。在 60 mm 培养皿中，15 ml 培养基可提供足够的安全深度，使针尖远离皿底。可先使用未校准的针进行初步练习，以熟悉此步骤的操作。首先使用 10x 物镜聚焦于培养皿底部细胞上方区域。此操作应避开对光敏感或关键实验细胞所在的区域。将针缓慢下移进入培养基中。左右移动针，寻找其投影。若未观察到，可略微下移并向前移动针，重复左右扫描。通过向后（或向前）及向下移动，找到针尖。</li>
	<li>转动左右调节螺钉，判断所见的是哪一根针。若其随螺钉转动而移动，则为参考针；若不动，则为已校准针。对于已校准针，使用左右调节螺钉推动参考针靠近它。前后移动针，寻找参考针的投影。若已找到的是参考针，则将其向左旋转，同时将液压装置向右移动，以寻找已校准针。</li>
	<li>当两根针均被定位后，使用双工具夹持器的微调控制将它们对齐。由于针以陡峭角度越过培养皿边缘，垂直调节在向上调整时会同时产生前向伸长效应，向下则缩短。左侧的前后调节螺钉作用相反：向前推动会使针尖向下进入培养皿，向后拉动则在撤回针的同时抬高针尖位置。因此，抬高参考针并向前推动已校准针，可使两根针在尖端处长度一致，同时优化其相对于培养皿的高度关系。若参考针远长于工作针，可通过螺钉/推力将工作针向下和向前移动，同时摆动参考针向下并缩短其长度，直至两者对齐且工作针位置更低。有时螺钉调节范围不足以使针靠近，此时可轻轻滑动针夹本身，确保球形接头螺钉已充分拧紧，并用手指抵住工具夹持器边缘施力推动轴杆滑动。也可如前所述，在培养基上方旋转针夹并观察效果，查看针尖是否逐渐靠近。</li>
	<li>记录此最终调整位置的图像，此时无外力作用下两针之间的距离即为零点参考距离。将针抬升至样本平面以上，并“停放”于视野边缘。</li>
	<li>可通过将针穿过液面弯月面来清除其上的碎屑。首先将参考针移离另一根针，以避免两针尖相互钩挂。可能需要多次重复此操作。</li>
</ol>
8. 细胞附着
<ol>
	<li>到目前为止，针头是通过显微镜直接观察的。从细胞附着开始，观察将同时通过显微镜和视频屏幕进行。两者的左右方向一致，但视频屏幕上图像的上下方向与显微镜下的（重力方向的）上下并不相同。为了明确通过显微镜直接观察到的上下方向与在视频屏幕上观察到的上下方向之间的差异，后者将被称为“上”和“下”，即加引号表示</li>
	<li>拖动操作是通过在视频屏幕上左右（“水平”）移动两根针头来完成的。因此，实验所选轴突应部分延伸在相同的“水平”方向上。轴突相对于“水平”方向最多可向下偏转15°，因为第8.5节中的“向上推”操作可以补偿这一偏差。此外，所选用于操作的轴突应至少为一个细胞体长度或更长，并具有活跃的生长锥。优先选择从细胞体向右延伸的轴突，这是由于双工具架的设置中工作针安装在参考针的左侧，因此在拖动过程中施加的张力会使两根针之间的间隙增大</li>
	<li>对于从细胞体向左延伸的优质轴突，可在不重新调整双工具架方向的情况下进行拖动，方法是增大针头之间的间隙并略微抬高参考针。这使得拖动针在必要时有更多空间向参考针弯曲并从其下方通过。此时拖动将向左推进，随着张力增加，拖动针会向参考针弯曲。在分析数据时，这种张力与参考距离关系的变化需输入电子表格中，具体做法是用零参考距离减去针头间距测量值，而不是用测量值减去零距离</li>
	<li>将针头移近轴突的生长锥，再次记录零距离，然后抬起针头，并开启隔振台的气源</li>
	<li>仅将工作针放置在前进中的生长锥前方，就可能在生长锥前进过程中引发自发附着。为了主动操控生长锥附着，可将拖动针置于生长锥“下方”，然后将其向下压至培养皿底部。这会导致针头向上偏转，沿皿面弯曲滑入生长锥，使其脱离原位并向“上方”移动。下压针头的力度应适中，使生长锥钩住针尖，但不能过度下压导致其滑过针尖并向后滑脱。等待20分钟，以确保牢固附着形成。有经验者操作的成功率可高达90%，但通常在75%左右；初学者的成功率可能接近25%。初学时最常见的错误是对生长锥“过度操作”。“向上推”步骤的初始接触仅需数秒，之后应让生长锥静置以形成稳固附着，随后的步骤中必须保持耐心</li>
	<li>当生长锥附着在针头上后，通过将针头向右移动施加轻微张力，并略微抬高针头。在抬高针头的同时，略微向前移动以补偿针头向下移动的趋势。分阶段抬高，直至附着的轴突从针头垂直伸出并高于培养皿表面。拖动开始后，轴突从针头垂直伸出的构型对于准确测力至关重要，即确保唯一施加的力矢量沿轴突轴线方向。如果被拖动的轴突偏离针头方向，则部分力会沿针头轴线传递，而非使针头弯曲，从而导致总力无法被准确测量。远离初始附着点有助于提高针头附着的持久性。针尖可略高于皿面（表现为轻微振动或与皿面处于不同焦平面），或以极小的力接触皿面。若表面阻力过大，将影响测量准确性。若针头粘附于皿面，或细胞突起重新附着于基底，继续尝试移动将导致力持续加载，随后可能突然“弹脱”，造成附着丢失。为使针头脱离粘附点，应前后移动针头（在屏幕平面内做“上”和“下”移动），而非增加向右的拉力</li>
</ol>
9. 轴突或细胞突起的延伸
<ol>
	<li>通过将微针从细胞体移开以施加微小的力来实现牵拉。随着微针之间间隙的逐渐增大，可观察到施加的力。在逐步增加张力的同时，需仔细观察生长锥是否从微针上脱离。</li>
	<li>如果生长锥脱离但未快速回缩，可略微降低张力并等待，生长锥通常会“追上”并再次抓住微针尖端。若轴突从微针上脱落，应在它回缩前用微针将其压在培养皿壁上以截获，并重复“向上推”或“向下拉”的操作，施加轻微张力，然后等待约10分钟以使其重新附着。若连续两次尝试失败，建议更换另一个细胞进行实验。</li>
	<li>通过每小时向培养皿中添加水以补偿蒸发，维持培养基液面高度，并以培养皿侧壁上的标记指示初始深度。使用长型巴斯德移液管，缓慢地在远离微针的培养皿侧壁处加水。若培养基变为高渗状态，常会导致突起延伸“停滞”。可在培养基表面覆盖一层油以减少蒸发，但油层必须在微针置入培养基后才能添加。若微针穿过油层，生长锥附着到微针上的可能性将显著降低。</li>
	<li>在实验结束、将微针从培养皿中取出之前，需重新检查零距离位置。</li>
</ol>
10. 数据分析
<ol>
	<li>在屏幕上沿水平轴读取针的位置、细胞体的位置并记录时间。针之间的间距减去无负载时的零距离，再乘以针的弯曲常数，即为施加的微达因（μdynes）力。使用载物台测微尺校准屏幕图像的距离。</li>
	<li>获得高质量数据的关键在于确保实验过程中针之间的参考距离（零力状态）保持不变。温度变化会在微米尺度上影响设备，例如实验期间切勿开启空调。如果显微镜加热系统存在滞后，应等待系统达到热稳定后再进行操作。Ringcubator 可缩短滞后时间，并将培养皿内的温度变化与显微镜及操作系统的其余部分隔离，从而减少零点漂移和焦点变化。另一个影响针无负载间距的因素是针杆表面的表面张力。液体深度的变化会导致负载改变。在实验过程中，偶尔通过后移针头并临时观察无外力作用下的零距离来检查参考距离，有助于提高数据质量，即使你已注意到间距发生了变化。</li>
</ol>
11. 代表性结果：
通过光学显微镜可直接观察到力校准的玻璃针可轻松应用于细胞的任何区域，通常是生长锥。通过对玻璃针进行适当处理以实现与细胞的附着，可对目标细胞区域施加实验性的机械张力，或测量该区域产生的力。图1展示了一个典型的神经元牵引实验，其中被牵引的轴突在两小时内长度增加了一倍。
<img src="/files/ftp_upload/2509/2509fig1.jpg" alt="延时显微镜显示神经突生长；时间点分别为 0:00、0:20、0:43、2:20。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 选择一个培养的鸡背根神经节细胞，其方向适合进行拖曳操作。在实验操作开始前，记录两根微针之间的初始零参考距离（A）。对生长锥实施“向上推”操作（B）。随着微针间距增大，表明施加的拉力增加，拖曳开始（C）。轴突已被拉长，被拖曳的轴突与工作微针呈“水平”且垂直排列，有利于获得准确的力学测量结果（D）。标尺 = 40 μm。微针校准系数 = 6.9 μdyne/μm。

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<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

施加和测量细胞力的技术有着悠久的历史9。我们的方法最初受到Dennis Bray工作的启发，他使用类似于我们的玻璃针，通过电动液压装置以恒定速率“牵引”神经元10。目前存在多种向细胞施加力的替代方法，包括：步进电机11、磁珠12、微加工梁13以及流体流动14。其中后一种方法与我们的方法类似，都是通过已知刚度的弯曲梁对细胞探针进行最终校准，并依赖光学显微镜观察来完成细胞测量。与其他方法相比，我们的方法3主要优势在于能够使用生命科学部门常见的设备（显微镜和显微操作器）同时施加并测量μdyne范围内的力。
利用这些方法，已测量出神经元生长锥前进时施加的力15。已确定轴突延伸速率对张力的力学响应关系遵循类似牛顿流体的刺激-响应关系7。研究表明，鸡胚中枢脑神经元对张力的相对敏感性高于外周神经元2。轴突回缩现象也已被研究7。对于尚未确定轴突的神经元，可通...

<table><tbody><tr><td>R-6 毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6 玻璃外径 0.9 mm，内径 0.6 mm，8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH 拉针仪</td><td>Mecanex S.A.，瑞士日内瓦</td><td>BB-CH 拉针仪</td><td>使用模式 4 Alt，CP=100，PP=10，SP1=1000，SP2=1000</td></tr><tr><td>0.001&quot; 铬镍合金丝</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>无护套热电偶丝，50 英尺线轴，现称为 Chromega</td></tr><tr><td>0.003&quot; 康铜合金丝</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>无护套热电偶丝，50 英尺线轴</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>通用显微镜悬臂支架</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 或 90430</td><td>大多数品牌或类型的悬臂支架均适用于此用途</td></tr><tr><td>机械式显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>三轴直驱粗调显微操作器</td></tr><tr><td>液压式显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>现可提供型号为 MMO-203，三轴可动类型</td></tr><tr><td>针持</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>一套三个</td></tr><tr><td>单仪器夹持器</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>双仪器夹持器</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>机械式显微操作器</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>立柱安装，1 个探针夹持器，RH 型号 430001</td></tr><tr><td>操纵杆式机械显微操作器</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>Vibraplane 隔振台</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 系列</td><td>我们的型号为 1201-02-12</td></tr><tr><td>环形培养箱（Ringcubator）</td><td>自制（参见参考文献 19）</td><td></td><td>参考文献 19，需使用下文列出的更新版控制器</td></tr><tr><td>可编程温度控制器</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>替代已停产的 PXV3 温度控制器</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>倒置显微镜，约 1980 年产品</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 双目解剖显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>其他解剖显微镜亦可使用</td></tr></tbody></table>

机械操控神经元以调控轴突发育

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

利用经过校准的玻璃微纤维可实现对细胞的操作以及神经元轴突的延伸，这些微纤维能够测量和施加10–1000 μdyne范围内的力1,2。通过观察玻璃针的胡克弹性弯曲来获取力的测量值，其校准采用直接且经验性的方法完成3。本文详细描述了针具的制备、校准、处理及在细胞上使用的设备要求和操作步骤。此前所使用的力的范围以及已应用这些技术的不同细胞类型展示了该方法的灵活性，并作为未来研究的示例予以提供4-6。该技术的优势在于能够连续“可视化”操作过程中产生的力，并可直接干预多种细胞事件，包括对轴突生长与回缩的直接刺激和调控7，以及对任何类型的培养细胞进行脱离操作和力学测量8。

使用经过校准的玻璃针，可高精度地对神经元施加并直接测量2-1000微达因范围内的作用力。该方法可用于控制和测量轴突发育的多个方面，包括轴突起始、轴突张力、轴突延伸速度以及力的矢量方向。

使用经过校准的玻璃微纤维可实现细胞操作及神经元轴突的延伸，这些微纤维能够测量和施加皮牛顿级别的作用力……

本实验的目标是在精确测量作用力的同时实现轴突的延伸。为此，首先制备经过直接校准的导线参考针，随后进行导线参考针的校准，并制备符合所需力范围的校准针、中间针和工作针。接着，利用工作针牵引生长锥，以实现轴突的拉长。通过记录轴突的延伸情况，并根据已校准针尖的弯曲程度来测量作用力。该方法可用于解答有关轴突延伸生物物理机制的关键问题。开始实验时，使用可调节的微针拉制仪和玻璃毛细管来制备尖端呈锥形、长度约为四毫米的微针。将针头存放于带盖的160毫米培养皿中。接下来，通过将一根直径为0.001英寸的铬合金丝插入尖端已折断的玻璃针内部来制作一根导线校准针。将导线从针尖拉出至26毫米长度，并用瞬干胶固定。将金属丝远端一毫米处弯成钩状。然后使用一米长、直径为0.003英寸的恒定金属丝制作微小砝码。测量金属丝时，将其用胶带固定在米尺上。为了尽可能将其弄直，称量一米长的导线并精确地将其切割成一厘米长的小段。将其中若干段导线弯成花瓶状。校准金属丝针头需要使用带有测量刻度的解剖显微镜和显微操作器。将显微镜侧向倾斜90度，利用通用支架固定，以便观察金属丝针头向下的偏转情况。将金属丝针安装在显微操作器的工具架上，使其与显微镜的光轴垂直。将金属丝针的钩子与基准标记对齐。在钩子上悬挂一厘米的微型砝码，并记录其偏转量。参考金属丝的弯曲常数等于微小重物的质量除以观测到的偏转量。校准后，使用剃刀在路径航点处切断钩子，以制备用于下一步的针尖，从而校准中间的玻璃针。需要配备目镜测微尺的倒置显微镜。显微镜载物台的一侧装有机械式显微操作器，用于固定金属丝针。另一侧则装有液压式显微操作器，用于移动中间的玻璃针。使用显微操作器将两根针在直径160毫米、高30毫米的培养皿中的水环境下，以45度角汇聚于光学视野中心，放大倍数为10×。随后，对每根针进行一系列偏转操作。记录玻璃针初始偏转量以及释放后零载荷时的最终位置。这将生成10组数据点。为进行线性回归分析，需从每组记录数据的第二个数值中减去初始偏转量，以准备这10组数据对。添加五组控制数据点（0, 0）到10组实验数据点中，以将线性回归锚定在零点，即零偏转、零力处。使用这15组数据点计算线性回归。中间玻璃针的弹簧常数等于已知弯曲常数的金属针除以回归直线的斜率。然后按照上述方法，用中间玻璃针对工作用玻璃针进行校准。每微米小于两微米的玻璃针可略微缩短，以使其进入合适的刚度范围。将待包被的针头插入固定在10毫升附件因子溶液上方的一块黏土侧面，使针尖依次浸入溶液中，仅针尖部分接触溶液。将针头浸入0.1%多聚赖氨酸溶液中30分钟，然后在加入伴刀豆球蛋白A的情况下，将针头浸入溶液中继续处理30分钟，同时对针头进行附件因子处理。打开培养箱或显微镜载物台加热系统，以使载物台达到热平衡状态。牵引工作站置于隔振台上，由一台倒置显微镜组成，显微镜配备有液压操纵器，该操纵器持有一个配重平衡的定制延伸装置，双工具夹持器插入其中。将一根未经校准的参考针插入针夹持器中，使其尽可能伸出。将此组件放置在双工具夹持器的右侧。然后将处理过的工作针插入另一针夹持器中，使其伸出长度为参考针的一半，并将其放置在双工具夹持器的左侧。将液压显微操作器预设为垂直控制调至最高位置。然后通过使用侧向调节螺钉使两根针尖相互靠近。定位针尖。因此，需从侧面目测检查一对针尖，并使用右侧的上下调节螺钉，使针尖处于同一平面。摆动工具架，将针尖放入培养基表面之上的光路中，并使其陡峭地向下对齐。拧紧底部的球形接头螺丝。使用10倍物镜，将焦点对准培养皿底部细胞上方的位置。将针头缓慢下降至培养基中，以便在显微镜视野内找到针尖。在将它们过度深入培养皿之前，左右或前后移动针头并观察其阴影。一旦看到针头，转动左右调节螺丝以确定所找到的是哪一根针头。如果随螺钉移动，则为参考针；如果不移动，则为校准针。确定两根针的位置后，使用双工具架的微调装置将它们对齐。目标是使针尖之间的距离约为50微米，或在显示器上约为一英寸。参考针应位于培养皿上方更远的位置，因此会略微失焦。当拖曳针在培养皿上处于焦点位置时，记录此最终调整位置的图像。针头之间的间距为零参考距离。将针头抬高至样本平面以上，并将其停放在视野边缘。根据书面实验方案中的指导原则，选择一条用于实验的轴突。将针头移至轴突生长锥附近，再次记录零距离。接着，充气升起隔振台，以操控生长锥接触针头。将牵引针放置在生长锥下方的一侧，然后将针头向下降低至培养皿底部。这将导致针头向上偏转，弯曲并沿培养皿滑入生长锥，随后使生长锥脱离并向上移动。将针头轻轻压向培养皿底部，使生长锥钩住针尖即可，但不要压得过深，以免生长锥从针头滑脱并向后滑动。等待20分钟，以确保固定牢固。当生长锥位于针上时，通过将针向右移动并略微上抬，对生长锥施加轻微张力；在上抬针的同时，向前微移针尖以补偿其向下的移动。分阶段上抬针，直至附着的突起垂直于针并伸展至培养皿表面之上。通过将针从细胞体移开即可实现拖曳操作。逐步施加力时，随着张力的逐渐增加，可观察到针尖之间的间距逐渐增大。需仔细观察生长锥是否出现从针尖脱离的迹象。为抵消蒸发，应每小时添加水以维持培养皿中的培养基液面高度。使用培养皿侧面的标记指示初始深度，将移液管置于培养皿侧壁远离针头的位置，缓慢加水直至达到标记处。在实验结束时，提起针头前，重新检查零点距离。读取屏幕上针头在水平轴上的位置。同时记录细胞体的位置，以及当针头分离距离减去无负载时的零距离，再乘以针头的弯曲常数，所得值等于所施加的力（单位为微米）时的时间点。此处显示的是一个细胞视野示例，其中包含多个可用于控制轴突发育的候选细胞。具有较大生长锥的水平轴突是理想的选择。将细胞体置于屏幕边缘附近，并将微针移近生长锥。拍摄未加载微针时的间距图像，此间距即为零距离。在实验开始前，先将牵引微针接触生长锥，以观察是否能够实现自发性附着。然后将针头进一步推入生长锥。通过将针头向下压向培养皿底部，使其弯曲并滑入生长锥，从而将其移位，完成上推动作。同时施加了少量的前向张力。15分钟后，轴突看起来已随着针头的前移而延伸。接下来，增加对牵引针的张力，并开始抬高针头。通过观察到针头之间距离增大，表明已施加了额外的张力。此时，轴突已明显延伸。参考针未向前移动，但轴突已朝其生长，导致张力减小。同时，针已略微抬高。此时，仍需向牵引针施加更大的张力。在弯曲的牵引针所施加的张力作用下，已产生显著的生长反应。实验结束时，需进行最终的零点校准检查。整个过程在此延时序列中得以展示。观看本视频后，您应能够充分理解如何校准针头、将生长锥操纵至针头上，以及在轴突延伸过程中测量作用力的方法。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

机械操纵控制神经元轴突的发展

开发了一种独特的组织工程技术，通过模拟轴突牵张生长，在培养中实现大量神经纤维的延长；轴突牵张生长是一种神经系统生长形式，神经随之身体的增大而同步伸长。...

轴突拉伸生长：神经元生长的力传导机制

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

神经元形态发生和迁移是大脑正常发育过程中的关键事件。本文介绍了在培养的小脑颗粒神经元及发育中的小脑中进行遗传学操作的方法，用于评估神经元的形态特征和迁移特性。...

小脑颗粒神经元的遗传操作 体外 和 体内 研究神经元形态与迁移

双光子成像结合激光纳米解剖技术是研究中枢神经系统中退行性与再生过程的有力工具，可实现亚细胞分辨率下的观察。本方案展示了如何在小脑皮层中对单根攀缘纤维进行标记、成像与解剖 体内.

小脑轴突的激光纳米手术 体内

结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。...

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。...

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

本实验方案描述了如何利用固定在微移液管上、经多聚-D-赖氨酸包被的微珠，引导神经突生长，从而在微流控腔室中快速启动、延伸并连接神经突。...

重连神经元回路：一种实现快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法

神经突生长实验可提供有关神经元再生过程的定量数据。该半自动软件的优势在于，通过创建掩膜将细胞体和神经突分别进行分割，并测量多种参数，如神经突长度、分支点数量、细胞体簇面积以及细胞簇数量。...

一种用于神经突生长测量的新型半自动软件的标准化

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

学习使用校准玻璃针在微达因范围内精确测量力以延伸轴突的方法。该技术可研究轴突起始与伸长动力学，为神经发育生物物理学提供可靠研究手段。

机械操控神经元以调控轴突发育

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