使用C2C12成肌细胞的生物能量谱分析实验

以下实验的总体目标是通过使用 XF 96 细胞外通量分析仪测量氧化代谢的多个参数，来检测活细胞和分离线粒体中线粒体的功能状态。这些参数包括基础呼吸、ATP 转换、质子漏和最大呼吸或备用呼吸能力。实验通过向 C2C12 成肌细胞依次添加特定的线粒体呼吸调节剂，测定氧消耗速率（OCR，即呼吸的指标）的变化，以及葡萄糖转化为乳酸的过程（通过糖酵解生成 ATP）。

细胞中的另一条主要能量通路也可通过ECAR（细胞外酸化率）进行测量。可获得线粒体功能分析结果，从而揭示线粒体功能在决定细胞寿命方面所起的核心作用。大家好，我叫David Nichols。

在我的整个职业生涯中，我一直是一名线粒体研究领域的科研工作者，而我在研究中使用过的最重要设备就是氧电极。如果你能够在不同条件下测量分离线粒体的耗氧速率，就能获得极为重要的信息。当你转向细胞研究时，尤其是培养在多孔板或盖玻片上的细胞，传统的研究方法就不再适用了。

这是一个重大难题，几年前通过开发一种多孔板检测方法得以解决，该方法使我们能够在多孔板体系中并行研究细胞的呼吸作用。今天您将看到的是一个非常简单但信息丰富的实验，我们设计该实验用于监测培养细胞中线粒体基本生物能量功能。首先，在XF 96细胞培养板中接种细胞，每孔10,000个细胞，加入100微升培养基，置于37摄氏度、含10%二氧化碳的培养箱中培养。

接种细胞24小时后，可使用XF 96分析仪进行检测。向导将生成一个具有以下分组布局的模板：第1至第12列均含有10,000个C2C12细胞。

蓝色的第一组作为对照细胞。红色的第二组将施加寡霉素（oligo Mycin）、FCCP 和 roone 药物。接下来，按照方案书面部分的描述，用 X-F-D-M-E-M 检测培养基配制化合物。

寡霉素、FCCP、鱼藤酮。这些化合物已预先分装在XF细胞线粒体应激测试试剂盒中。使用XF加样工作站，将培养基更换为DMEM运行培养基。

最后，将细胞置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育60分钟，以使细胞在向传感器微孔板中加入可注射化合物之前预先与检测培养基达到平衡，并将化合物预热至37摄氏度。然后按以下方式将化合物加入进样孔中：对于第1至第4列，在A、B和C孔中分别加入16、18和20微升XF检测培养基或DMEM。

对于第5至第12列，向A孔加入16 µL的liga mycin，向B孔加入18 µL的FCCP，向C孔加入20 µL的rot known。接下来，定义实验方案：将循环次数设为3次，混合时间为3分钟，检测时间设为3分钟。然后，点击开始。

按照屏幕上的指示操作，在校准完成后，系统会提示用户何时加载试剂盒。根据用户提示，添加用于实验的细胞板，然后单击继续，运行检测程序。

实验结束后取出培养板。本检测方法源自经典的线粒体功能分析实验，可作为研究各种化合物对细胞代谢、线粒体功能及整体生物能量活动影响的复杂实验设计框架。在此实验中，我们观察到细胞经逐次添加化合物处理后，其耗氧速率呈现出预期的反应变化。

由于阻断了线粒体复合体五的ATP合成，寡霉素处理导致ATP水平下降。由于细胞在寡霉素处理后无法通过氧化磷酸化合成ATP，因此转而依赖糖酵解来满足其对ATP的需求。因此，我们观察到细胞外酸化率（ECAR）增加，这是糖酵解的指标，与先前报道结果一致。FCCP作为一种解偶联剂，可消除质子回流的限制。

呼吸作用加快，此时受限于电子传递。最后，已知的抑制剂抑制了线粒体复合物Ⅰ，导致电子传递链中的电子流动停止，因此氧气消耗量显著减少。通过该过程可获得细胞基础呼吸的信息，用于ATP生成的氧气消耗所占的百分比，以及因质子泄漏而用于维持质子梯度的氧气消耗量。

此外，我们还可以在非耦合呼吸条件下获得最大呼吸速率，有时也称为备用呼吸能力。最后，我们能够确定非线粒体过程所导致的耗氧量。您刚刚已经通过 Seahorse 观察到了这一点。

XF 96 是一系列实验，可提供大量关于细胞线粒体生物能量学的信息。其中最基本且极为重要的实验，我们称之为实验一，可提供关于基础呼吸、ATP 转换、线粒体质子漏和备用呼吸能力的信息。这些参数可为您提供有关细胞内线粒体生物能量状态的基本信息。