小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

本实验的总体目标是分离气道上皮细胞，以研究香烟烟雾暴露的毒性作用。该目标通过首先解剖小鼠气管，然后将气管置于pronase溶液中进行消化来实现。实验的第二步是收集上皮细胞并建立液体培养体系。

第三步是在气液界面处对培养物进行分化。该实验流程的最后一步是在气液界面处将上皮细胞暴露于顶端香烟烟雾中。最终，可通过免疫荧光显微镜观察到结果，显示上皮细胞已形成完全分化的单层结构。

该方法有助于解答慢性阻塞性肺疾病领域中的关键问题，例如香烟烟雾暴露对CLIA形态的影响以及香烟烟雾诱导的细胞损伤生化标志物。在解剖前一天开始准备实验，包括配制hams。含抗生素的F 12培养基、含抗生素和20%F-B-S-M-T-E-C的F 12培养基，以及含抗生素的基础培养基。

根据书面方案中的说明，配制含5%FBS的MTEC培养基、DNA的一种溶液、视黄酸储备液以及MTEC增殖培养基。在解剖当天，对将用于解剖的所有手术器械进行灭菌。确保解剖区域清洁，并备齐所有解剖工具。

对组织培养超净台进行灭菌。随后在组织培养超净台内操作，配制0.15%的蛋白酶溶液。

在50毫升锥形管中，将15毫克蛋白酶加入含有抗生素的10毫升Hams F-12培养基中。使用前置于冰上保存。

采用标准外科手术方法从小鼠中分离气管，对装有气管的试管进行消毒，并置于组织培养操作台中。将气管组织转移至含有抗生素的100毫米培养皿中的Hams F12培养基中。使用无菌外科镊子去除气管上的结缔组织。

然后将清洁的气管转移至第二个含有含抗生素的Ham's F12培养基的100毫米培养皿中。使用解剖剪沿气管垂直轴剪开，暴露管腔。

将气管转移至含有10毫升蛋白酶溶液的50毫升锥形管中，置于冰箱中于4摄氏度孵育过夜。最后，制备经I型胶原处理的Transwell板备用。次日，加入50毫克胶原，每毫升0.02 N乙酸溶解，用移液器将1毫升该溶液加入12孔板的每个孔中。

将培养板中的液体转移至另一个培养板中。用封口膜包裹培养板，并在组织培养超净台中室温静置过夜。第二天。

轻轻倒置含有小鼠气管的离心管10至12次。然后将离心管中的内容物在4°C条件下继续孵育30至60分钟。在组织培养超净台中，用移液器将10毫升含有抗生素并添加20% FBS的Hams F12培养基加入含有已消化气管组织的锥形管中，并倒置12次。

然后用移液器将含有抗生素的 10 毫升含 20% FBS 的 Hams F12 培养基加入三个 15 毫升锥形管中。使用无菌的巴氏移液器将气管组织从链霉蛋白酶溶液转移至第一个含有添加物的 Hams F12 培养基的管中。

将 Pronase 溶液置于冰上，盖紧含有气管组织的离心管，轻轻倒置 12 次以混匀。然后使用意面移液管将气管组织转移至第二个 15 毫升锥形管中，并将该管倒置 12 次。使用最后一个 15 毫升锥形管重复上述转移和倒置操作。

最后，使用移液管移除并弃去气管组织。然后将嗜热菌蛋白酶（pronase）溶液从冰上取出，并将三份15毫升的添加物hams F12培养基与嗜热菌蛋白酶溶液混合。将样品在预冷的离心机中于4°C、1,400 rpm条件下离心10分钟。离心结束后弃去上清液，然后每份气管组织沉淀中加入约100至200微升的DNA酶I溶液，重新悬浮。

轻轻敲击悬浮细胞。将细胞在冰上孵育5分钟。在4°C条件下以1,400转/分钟离心5分钟，弃去上清液。

然后用移液器将8 mL含有10%胎牛血清（FBS）的MTEC培养基加入沉淀中，并重悬细胞。将细胞悬液置于培养板中，在37°C、95%空气和5%二氧化碳的气氛条件下孵育5至6小时。此为去除成纤维细胞的阴性筛选步骤。

孵育结束后，从培养板中收集细胞悬液，并用移液器转移至50毫升锥形管中。随后用4毫升含10%胎牛血清（FBS）的MTEC培养基将培养板冲洗两次，将两次洗涤液均转移至含有细胞悬液的50毫升锥形管中。

用移液器将一毫升细胞悬液转移至离心管中。保留此等分试样用于细胞涂片分析及细胞计数离心。将含有剩余15毫升细胞悬液的50毫升锥形管在4°C条件下以1,400转/分钟离心10分钟。

离心过程中，移除并弃去先前准备的Transwell板中的胶原溶液。将板置于超净台中干燥5分钟，末次洗涤后用PBS洗涤两次。吸除全部PBS，离心后向Transwell的基底室中加入1.5毫升增殖培养基。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量增殖培养基中，以利于在每孔500 µL悬浮液中接种7.5 × 10⁴至1 × 10⁵个细胞。用移液器将500 µL细胞悬液加入Transwell聚碳酸酯膜插入片的顶端表面。将MTEC培养物浸没于培养基中，在37 °C、含95%空气和5%二氧化碳的湿化培养箱中培养7至10天，每隔一天更换一次培养基。

使用间隔计测量跨上皮细胞电阻。当上皮细胞电阻达到每平方厘米1000欧姆且培养物呈现融合状态时，通过移除顶端培养基将其转换为LI培养。

同时将基础培养基更换为含有2%新血清和视黄酸的MTEC基础培养基。将培养物置于37°C和5%二氧化碳条件下培养10至14天，每隔一天更换一次培养基，以促进细胞分化。首先，根据制造商的说明设置吸烟机。

记录一个未使用的极性滤膜的重量。然后将该滤膜置于采样管路上的在线不锈钢滤膜 holder 中，该管路从吸烟室的采样口通向恒流泵。使用流出管路将采样单元连接至气体计量表，采用 CS 细胞暴露系统。

将跨孔培养物的顶端暴露于三支R4F研究用标准带滤嘴香烟的主流烟雾中，使细胞暴露于一支至两支香烟的烟雾。在气体采样后，对照培养物在相同暴露时间内暴露于室内空气中。

对于泳池夹心滤膜，滤膜上沉积的总物质质量（以毫克计）进行归一化处理。根据采样空气的总体积，一支至两支香烟产生的烟雾通常可产生每立方米100至200毫克的总颗粒物（TPM）。香烟暴露后，收集细胞及基础培养基用于后续分析。

这是经细胞核、上皮细胞及C标志物染色的小鼠呼吸道上皮细胞健康单层的一个示例。成功的上皮细胞分离、增殖与分化依赖于具有鹅卵石样形态的完整单层结构。这些培养物基本上无成纤维细胞污染。

这些电子显微镜图像代表了健康的MTEC培养物，展示了不同类型细胞以及纤毛的超微结构和形态。该活细胞成像视频显示了MTEC培养物中健康的纤毛形态。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离小鼠气管上皮细胞，在气液界面条件下使其分化，并将其暴露于主流香烟烟雾中。